Súprava Cell Direct RT qPCR – SYBR GREEN I Direct Cell Lysis Cell Ready Súpravy qRT-PCR v jednom kroku
Popisy
Táto súprava využíva jedinečný systém lyzačného pufra, ktorý dokáže rýchlo uvoľniť RNA zo vzoriek kultivovaných buniek pre reakcie RT-qPCR, čím sa eliminuje časovo náročný a pracný proces purifikácie RNA.Templát RNA je možné získať len za 7 minút.5×Direct RT Mix a 2×Reagencie Direct qPCR Mix-SYBR poskytované súpravou môžu rýchlo a efektívne získať kvantitatívne výsledky PCR v reálnom čase.
5×Direct RT Mix a 2×Direct qPCR Mix-SYBR má silnú toleranciu voči inhibítorom a lyzát vzoriek možno použiť priamo ako templát pre RT-qPCR.Táto súprava obsahuje unikátnu RNA vysokoafinitnú reverznú transkriptázu Foregene a Hot D-Taq DNA polymerázu, dNTPs, MgCl2, reakčný pufor, PCR optimalizátor a stabilizátor.
technické údaje
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Komponenty súpravy
| Časť I | Pufr CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Buffer ST | |
| Časť II | DNA Eraser |
| 5× Direct RT Mix | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | |
| 50× referenčné farbivo ROX | |
| ddH20 bez RNázy | |
| Inštrukcie | |
Vlastnosti a výhody
■Jednoduché a efektívne: s technológiou Cell Direct RT je možné získať vzorky RNA len za 7 minút.
■ Požiadavka na vzorku je malá, možno otestovať len 10 buniek.
■ Vysoká priepustnosť: dokáže rýchlo detegovať RNA v bunkách kultivovaných v 384, 96, 24, 12, 6-jamkových platniach.
■ DNA Eraser môže rýchlo odstrániť uvoľnené genómy a výrazne znížiť vplyv na následné výsledky experimentov.
■ Optimalizovaný systém RT a qPCR robí dvojkrokovú reverznú transkripciu RT-PCR efektívnejšou a PCR špecifickejšou a odolnejšou voči inhibítorom reakcie RT-qPCR.
Aplikácia súpravy
Rozsah použitia: kultivované bunky.
- RNA uvoľnená lýzou vzorky: použiteľné len pre RT-qPCR templát tejto súpravy.
- Súpravu je možné použiť na nasledujúce účely: analýza génovej expresie, overenie efektu umlčania génov sprostredkovaného siRNA, skríning liekov atď.
Diagram
Skladovanie a trvanlivosť
Časť I tejto súpravy by sa mala skladovať pri teplote 4 °C;Časť II by sa mala skladovať pri teplote -20 °C.
Foregene Protease Plus II sa má uchovávať pri 4℃, nezmrazovať pri -20 ℃.
Činidlo 2×Direct qPCR Mix-SYBR by sa mal skladovať pri -20℃v tme;pri častom používaní sa dá uložiť aj na 4℃ na krátkodobé skladovanie (spotrebujte do 10 dní).
Princípy návrhu primérov PCR v reálnom čase
Forward Primer a Reverse Primer
Pre Real Time PCR je veľmi dôležitý návrh priméru.Priméry súvisia so špecifickosťou a účinnosťou amplifikácie PCR a môžu byť navrhnuté s odkazom na nasledujúce princípy:
Dĺžka priméru: 18-30 bp.
Obsah GC: 40-60 %.
Hodnota Tm: Softvér na návrh základného náteru, ako napríklad Primer 5, môže poskytnúť hodnotu Tm základného náteru.Hodnoty Tm upstream a downstream primérov by mali byť čo najbližšie.Môže sa použiť aj vzorec na výpočet Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Pri vykonávaní PCR sa ako teplota nasadenia vo všeobecnosti vyberie teplota pod hodnotou Tm priméru 5 °C (zodpovedajúce zvýšenie teploty nasadenia môže zvýšiť špecifickosť reakcie PCR).
Priméry a produkty PCR:
Dĺžka produktu amplifikácie PCR priméru je výhodne 100 až 150 bp.
Navrhovaným základným náterom v sekundárnej štruktúrnej oblasti šablóny by ste sa mali čo najviac vyhnúť.
Vyhnite sa tvorbe 2 alebo viacerých komplementárnych báz medzi 3' koncami upstream a downstream primérov.
Primer 3′ terminálová základňa nemôže byť prítomná s 3 dodatočnými po sebe idúcimi G alebo C.
Priméry samotné nemôžu mať komplementárne štruktúry, inak sa vytvorí vlásenková štruktúra, ktorá ovplyvňuje PCR amplifikáciu.
ATCG by sa malo distribuovať čo najrovnomernejšie v sekvencii primérov a 3 'terminálna báza by sa mala vyhnúť ako T.
Príloha 1：Doplnkový balík komponentov súpravy Cell Direct RT-qPCR
1.Roztok na bunkovú lýzu
|
| |||
| Komponenty súpravy (24-jamkový lýzový systém / jamka) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| Časťja | Pufr CL | 20 ml | 100 ml |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Buffer ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
| ČasťII | DNA Eraser | 400 μl | 1 ml × 2 |
2.RT Mix
|
| |
| Komponenty súpravy (20 μl reakčného systému) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5× Direct RT Mix | 800 μl |
| ddH bez RNázy2O | 1,7 ml × 2 |
|
| ||
| Komponenty súpravy (20 μl reakčného systému) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 |
| 50× referenčné farbivo ROX | 40 μl | 200 μl |
| ddH bez RNázy2O | 1,7 ml | 10 ml |
Návody na použitie:
