Žiadne zosilňovacie signály

1. Taq DNA polymeráza v súprave stráca svoju aktivitu v dôsledku nesprávneho skladovania alebo exspirácie súpravy.
Odporúčanie: Potvrďte podmienky skladovania súpravy;znovu pridajte vhodné množstvo Taq DNA polymerázy do systému PCR alebo si zakúpte novú súpravu Real Time PCR Kit pre súvisiace experimenty.

2. V templáte DNA je veľa inhibítorov Taq DNA polymerázy.
Návrh: Prečistite šablónu alebo znížte množstvo použitej šablóny.

3. Koncentrácia Mg2+ nie je vhodná.
Odporúčanie: Koncentrácia Mg2+ v nami poskytovanom 2× Real PCR Mix je 3,5 mM.Avšak pre niektoré špeciálne priméry a templáty môže byť koncentrácia Mg2+ vyššia.Preto môžete priamo pridať MgCl2 na optimalizáciu koncentrácie Mg2+.Kvôli optimalizácii sa odporúča zakaždým zvýšiť Mg2+ o 0,5 mM.

4. Podmienky amplifikácie PCR nie sú vhodné a sekvencia primérov alebo koncentrácia sú nevhodné.
Návrh: potvrďte správnosť sekvencie priméru a primér nebol degradovaný;ak amplifikačný signál nie je dobrý, skúste znížiť teplotu žíhania a primerane upravte koncentráciu priméru.

5. Množstvo šablóny je príliš malé alebo príliš veľké.
Odporúčanie: Vykonajte riedenie gradientom linearizácie templátu a vyberte koncentráciu templátu s najlepším efektom PCR pre experiment PCR v reálnom čase.

NTC má príliš vysokú hodnotu fluorescencie

1.Kontaminácia činidlom spôsobená počas prevádzky.
Odporúčanie: Vymeňte za nové reagencie pre experimenty PCR v reálnom čase.

2. Ku kontaminácii došlo počas prípravy reakčného systému PCR.
Odporúčanie: Počas prevádzky urobte potrebné ochranné opatrenia, ako napríklad: noste latexové rukavice, používajte špičku pipety s filtrom atď.

3. Priméry sú degradované a degradácia primérov spôsobí nešpecifickú amplifikáciu.
Návrh: Pomocou elektroforézy SDS-PAGE zistite, či sú priméry degradované, a nahraďte ich novými primérmi pre experimenty PCR v reálnom čase.

Primérový dimér alebo nešpecifická amplifikácia

1. Koncentrácia Mg2+ nie je vhodná.
Odporúčanie: Koncentrácia Mg2+ v nami poskytovanom 2× Real PCR EasyTM Mix je 3,5 mM.Avšak pre niektoré špeciálne priméry a templáty môže byť koncentrácia Mg2+ vyššia.Preto môžete priamo pridať MgCl2 na optimalizáciu koncentrácie Mg2+.Kvôli optimalizácii sa odporúča zakaždým zvýšiť Mg2+ o 0,5 mM.

2. Teplota žíhania PCR je príliš nízka.
Návrh: Zvýšte teplotu žíhania PCR zakaždým o 1 °C alebo 2 °C.

3. Produkt PCR je príliš dlhý.
Odporúčanie: Dĺžka produktu PCR v reálnom čase by mala byť medzi 100-150 bp, nie viac ako 500 bp.

4. Priméry sú degradované a degradácia primérov povedie k objaveniu sa špecifickej amplifikácie.
Návrh: Pomocou elektroforézy SDS-PAGE zistite, či sú priméry degradované, a nahraďte ich novými primérmi pre experimenty PCR v reálnom čase.

5. Systém PCR je nesprávny alebo je príliš malý.
Návrh: Systém reakcie PCR je príliš malý, čo spôsobí zníženie presnosti detekcie.Na opätovné spustenie experimentu PCR v reálnom čase je najlepšie použiť reakčný systém odporúčaný nástrojom na kvantitatívnu PCR.

Zlá opakovateľnosť kvantitatívnych hodnôt

1. Prístroj nefunguje správne.
Návrh: Medzi každým otvorom PCR v prístroji môžu byť chyby, čo má za následok zlú reprodukovateľnosť počas riadenia teploty alebo detekcie.Skontrolujte prosím podľa pokynov príslušného prístroja.

2. Čistota vzorky nie je dobrá.
Odporúčanie: Nečisté vzorky budú viesť k zlej reprodukovateľnosti experimentu, čo zahŕňa čistotu templátu a primerov.Najlepšie je prečistiť templát a priméry sa najlepšie purifikujú pomocou SDS-PAGE.

3. Čas prípravy a skladovania systému PCR je príliš dlhý.
Návrh: Systém Real Time PCR použite na experiment PCR ihneď po príprave a nenechávajte ho bokom príliš dlho.

4. Podmienky amplifikácie PCR nie sú vhodné a sekvencia primérov alebo koncentrácia sú nevhodné.
Návrh: potvrďte správnosť sekvencie priméru a primér nebol degradovaný;ak amplifikačný signál nie je dobrý, skúste znížiť teplotu žíhania a primerane upravte koncentráciu priméru.

5. Systém PCR je nesprávny alebo je príliš malý.
Návrh: Systém reakcie PCR je príliš malý, čo spôsobí zníženie presnosti detekcie.Na opätovné spustenie experimentu PCR v reálnom čase je najlepšie použiť reakčný systém odporúčaný nástrojom na kvantitatívnu PCR.