1. Počiatočné pochopenie

V tejto fáze musíme pochopiť niektoré pojmy a terminológiu, aby sme predišli chybám pred našimi seniormi, ako napríklad:

Otázka: Aký je rozdiel medzi RT-PCR, qPCR, PCR v reálnom čase a RT-PCR v reálnom čase?

Odpoveď: RT-PCR je reverzná transkripčná PCR(reverzná transkripčná PCR, RT-PCR), čo je široko používaný variant polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).V RT-PCR sa vlákno RNA reverzne transkribuje do komplementárnej DNA, ktorá sa potom používa ako templát na amplifikáciu DNA pomocou PCR.
Real-time-PCR a qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) sú to isté, obe sú kvantitatívne PCR v reálnom čase, čo znamená, že každý cyklus PCR má záznamy údajov v reálnom čase, takže počet počiatočných šablón je možné upraviť presnou analýzou.

Hoci sa zdá, že real-time PCR (real-time fluorescenčná kvantitatívna PCR) aj reverzná transkripčná PCR (reverzná transkripčná PCR) sú skrátené ako RT-PCR, medzinárodná konvencia je: RT-PCR špecificky označuje reverznú transkripciuPCR , Real-time PCR je všeobecne skrátená ako qPCR (kvantitatívna real-time PCR).

A RT-PCR v reálnom čase (RT-qPCR), je to reverzná transkripčná PCR kombinovaná s fluorescenčnou kvantitatívnou technológiou: najprv získajte cDNA (RT) z reverznej transkripcie RNA a potom použite Real-time PCR na kvantitatívnu analýzu (qPCR).Väčšina laboratórií robí RT-qPCR, teda výskum zníženia expresie RNA, takže qPCR, o ktorej každý v laboratóriu hovorí, sa v skutočnosti vzťahuje na RT-qPCR, ale nezabúdajte, že v klinických aplikáciách je stále veľa testov DNA.Kvantitatívna analýza, ako je detekcia vírusu hepatitídy B HBV.

Otázka: Prečo by mal byť po prečítaní množstva fluorescenčnej kvantitatívnej PCR kontrolovaný amplifikovaný fragment v rozsahu 80-300 bp?

Odpoveď: Dĺžka každej génovej sekvencie je rôzna, niektoré majú niekoľko kb, iné stovky bp, ale pri navrhovaní primerov potrebujeme iba dĺžku produktu 80-300 bp, príliš krátke alebo príliš dlhé nie sú vhodné na fluorescenčnú kvantitatívnu PCR detekciu.Fragment produktu je príliš krátky na to, aby sa dal odlíšiť od primer-diméru.Dĺžka primer-dimér je približne 30-40 bp a je ťažké rozlíšiť, či ide o primer-dimér alebo produkt, ak je menší ako 80 bp.Ak je fragment produktu príliš dlhý, presahuje 300 bp, ľahko to povedie k nízkej účinnosti amplifikácie a nemôže účinne detegovať množstvo génu.

Napríklad, keď spočítate, koľko ľudí je v triede, stačí spočítať, koľko je tam úst.To isté platí, keď detegujete gény, potrebujete len odhaliť určitú sekvenciu génu, ktorý bude reprezentovať celú sekvenciu.Ak chcete počítať ľudí, musíte počítať ústa aj nos, uši a okuliare a je ľahké robiť chyby.

Aby sme to rozšírili, v biologickom výskume existuje veľa výskumných prípadov z bodu do oblasti, pretože génová sekvencia akéhokoľvek druhu je veľmi dlhá, je zbytočné a nemožné merať všetky fragmenty, ako napríklad sekvenovanie bakteriálneho 16S, ktoré má vykonať konzervatívnu sekvenciu baktérií, aby sa odvodil počet určitej populácie baktérií.

Otázka: Aká je optimálna dĺžka pre návrh primeru qPCR?

Odpoveď: Všeobecne povedané, dĺžka priméru je približne 20-24 bp, čo je lepšie.Samozrejme, pri návrhu primeru musíme dbať na hodnotu TM primeru, pretože tá súvisí s optimálnou teplotou žíhania.Po mnohých experimentoch sa ukázalo, že 60°C je lepšia hodnota TM.Ak je teplota žíhania príliš nízka, ľahko to povedie k nešpecifickej amplifikácii.Ak je teplota žíhania príliš vysoká, účinnosť zosilnenia bude relatívne nízka, vrchol amplifikačnej krivky začne neskôr a hodnota CT sa oneskorí.

Otázka: Ako sa metóda farbenia líši od metódy sondy?

Odpoveď: Farbivá metódaNiektoré fluorescenčné farbivá, ako napríklad SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO atď., samy o sebe nevyžarujú svetlo, ale po naviazaní na vedľajšiu drážku dvojvláknovej DNA vyžarujú fluorescenciu.Preto na začiatku PCR reakcie nemôže zariadenie detekovať fluorescenčný signál.Keď reakcia dosiahne štádium žíhania-predlžovania, dvojvlákno sa otvorí a nové vlákno sa syntetizuje pôsobením DNA polymerázy a fluorescenčná molekula sa naviaže na vedľajšiu drážku dsDNA.So zvyšujúcim sa počtom cyklov PCR sa čoraz viac farbív kombinuje s dvojvláknovou DNA a fluorescenčný signál sa tiež neustále zvyšuje.Farbivá metóda sa používa najmä vo vedeckom výskume.
PS: Pri experimente buďte opatrní, farbivo sa musí skombinovať s ľudskou DNA, dávajte pozor, aby ste z nej urobili fluorescenčnú osobu.

Metóda farbenia (vľavo) Metóda sondy (vpravo)
PS: Pri experimente buďte opatrní, farbivo sa musí skombinovať s ľudskou DNA, dávajte pozor, aby ste z nej urobili fluorescenčnú osobu.

SYBR Green Ⅰ sa viaže na malú drážku DNA

Metóda sondySonda Taqman je najbežnejšie používaná sonda na hydrolýzu.Na 5′ konci sondy je fluorescenčná skupina, zvyčajne FAM, a samotná sonda je sekvencia komplementárna k cieľovému génu.Na 3' konci je fluorescenčná zhášacia skupina.Podľa princípu fluorescenčného rezonančného prenosu energie (Försterov rezonančný prenos energie, FRET), keď reportérová fluorescenčná skupina (donorová fluorescenčná molekula) a zhášajúca fluorescenčná skupina (akceptorová fluorescenčná molekula) sú excitované Keď sa spektrá prekrývajú a vzdialenosť je veľmi blízka (7-10 nm), excitácia donorovej molekuly môže indukovať autoorescenciu, zatiaľ čo akceptovaná fluorescencia je akceptovaná.Preto na začiatku PCR reakcie, keď je sonda voľná a neporušená v systéme, reportérová fluorescenčná skupina nebude emitovať fluorescenciu.Pri anelácii sa primér a sonda naviažu na templát.Počas fázy predlžovania polymeráza nepretržite syntetizuje nové reťazce.DNA polymeráza má 5′-3′ exonukleázovú aktivitu.Keď DNA polymeráza dosiahne sondu, hydrolyzuje sondu od templátu, oddelí reportérovú fluorescenčnú skupinu od zhášacej fluorescenčnej skupiny a uvoľní fluorescenčný signál.Keďže medzi sondou a templátom existuje vzťah jedna ku jednej, sondová metóda je lepšia ako metóda farbenia, pokiaľ ide o presnosť a citlivosť testu.Metóda sondy sa používa najmä v diagnostike.

Otázka: Čo je absolútna kvantifikácia?Čo je to relatívna kvantifikácia?

Odpoveď: Absolútna kvantifikácia sa týka výpočtu počiatočného počtu kópií vzorky, ktorá sa má testovať pomocou qPCR, napríklad koľko vírusov HBV je v 1 ml krvi.Výsledok získaný relatívnou kvantifikáciou je zmena v množstve cieľového génu v špecifickej vzorke v porovnaní s inou referenčnou vzorkou a expresia génu je up-regulovaná alebo down-regulovaná.

Otázka: Ovplyvní množstvo extrakcie RNA, účinnosť reverznej transkripcie a účinnosť amplifikácie experimentálne výsledky?
Otázka: Ovplyvní skladovanie vzoriek, extrakčné činidlá, reverzné transkripčné činidlá a spotrebný materiál prepúšťajúci svetlo výsledky experimentu?
Otázka: Aká metóda môže opraviť experimentálne údaje?

Pokiaľ ide o tieto problémy, podrobne ich popíšeme v sekcii pre pokročilých a pokročilých nižšie.
2. Pokročilé znalosti

Čo sa týka fluorescenčnej kvantitatívnej PCR v reálnom čase, musíme uznať skutočnosť, že každý rok sa publikujú tisíce vedeckých výskumných prác, medzi ktorými nie je málo ani technológia fluorescenčnej kvantitatívnej PCR.

Ak neexistuje spoločný štandard na meranie fluorescenčného kvantitatívneho PCR experimentu, výsledky sa môžu značne líšiť.Pre ten istý gén rovnakého druhu, s rovnakou metódou spracovania, sa budú výsledky detekcie tiež značne líšiť a pre oneskorencov bude ťažké zopakovať rovnaké výsledky.Nikto nevie, čo je správne a čo nie.

Znamená to, že fluorescenčná kvantitatívna PCR je podvodná alebo nespoľahlivá technológia?Nie, je to preto, že fluorescenčná kvantitatívna PCR je citlivejšia a presnejšia a trochu nesprávna operácia prinesie úplne opačné výsledky.Malá strata je vzdialená tisíc míľ.Autor článku môže byť recenzentmi opakovane mučený.Recenzenti časopisu si zároveň ťažko vyberajú z rôznych experimentálnych výsledkov.

Celkovo vzaté, čo poukazuje na nedostatok konsenzu v experimentoch PCR v reálnom čase.Na tento účel začali starší vedci v tomto odvetví formulovať normy,vyžadujúce, aby prispievatelia poskytli niektoré potrebné podrobnosti o experimentoch a spracovaní údajov (vrátane potrebných údajov) v článku na splnenie týchto noriem.

Recenzenti môžu posúdiť kvalitu experimentu prečítaním týchto podrobností;budúci čitatelia to môžu použiť aj na zopakovanie experimentu alebo zlepšenie experimentu.Potom sú takto získané experimentálne výsledky plné informácií, kvalitné a použiteľné.

MIBBI (Minimálne informácie pre biologické a biomedicínske výskumy -http://www.mibbi.org) bolo stvorené.MIBBI je projekt, ktorý poskytuje štandardy pre experimenty.Vydáva sa v prírode.Tento projekt je zameraný na rôzne biologické experimenty, vrátane bunkovej biológie, Microarray, qPCR, o ktorých teraz budeme diskutovať atď., a zabezpečuje každý typ experimentu pri predkladaní rukopisov.Tieto informácie by sa mali poskytovať vždy.

V projekte MIBBI sú dva články súvisiace s fluorescenčnou kvantitatívnou PCR, a to:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – štruktúrovaný jazyk a sprievodca reportovaním pre kvantitatívne PCR dáta v reálnom čase;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – minimum informácií pre publikovanie článkov o kvantitatívnych PCR experimentoch v reálnom čase.
Najprv si povedzme o RDML, terminologickej špecifikácii.

Ak neexistuje štandardná definícia pre všetko, nie je možné pokračovať v diskusii, preto je vysvetlenie pojmov na skúške také dôležité.
Terminológia použitá vo fluorescenčnom kvantitatívnom PCR experimente zahŕňa nasledujúci obsah.QIAGEN pre nás urobil to najlepšie zhrnutie.Nasledujúce sú všetky suchétovar .

Amplifikačná krivka
Amplifikačná krivka sa vzťahuje na krivku urobenú počas procesu PCR, pričom číslo cyklu je na vodorovnej osi a intenzita fluorescencie v reálnom čase počas reakcie na osi y.

Vynikajúca krivka zosilnenia by mala mať nasledujúce charakteristiky: základná línia je plochá alebo mierne znížená a nie je zjavný vzostupný trend;inflexný bod krivky je jasný a sklon exponenciálnej fázy je úmerný účinnosti zosilnenia.Čím väčší je sklon, tým vyššia je účinnosť zosilnenia;celková krivka zosilnenia Paralelnosť je dobrá, čo naznačuje, že účinnosť zosilnenia každej elektrónky je podobná;exponenciálna fáza amplifikačnej krivky vzoriek s nízkou koncentráciou je zrejmá.

základná línia (základná línia)
Základnou líniou je hladina hluku počiatočného cyklu, zvyčajne merané medzi 3. a 15. cyklom, pretože zvýšenie hodnoty fluorescencie spôsobené produktom amplifikácie nemôže byť počas tohto obdobia detekované.Počet cyklov použitých na výpočet základnej línie sa môže meniť a môže byť potrebné ho znížiť, ak sa použijú vysoké množstvá templátu alebo ak je úroveň expresie cieľového génu vysoká.

Nastavenie základnej línie vyžaduje zobrazenie údajov o fluorescencii z krivky amplifikácie linearity.Základná línia je nastavená tak, že rast amplifikačnej krivky začína číslom cyklu väčším ako je najvyššie číslo cyklu základnej línie.Základné línie je potrebné nastaviť individuálne pre každú cieľovú sekvenciu.Priemerné hodnoty fluorescencie zistené v skorých cykloch je potrebné odpočítať od hodnôt fluorescencie získaných v amplifikovaných produktoch.Najnovšie verzie rôznych softvérov Real-Time PCR umožňujú automatickú optimalizáciu základných nastavení pre jednotlivé vzorky.

Počas niekoľkých prvých cyklov amplifikačnej reakcie PCR sa fluorescenčný signál príliš nemení.Približovanie sa k priamke sa nazýva základná línia, ale ak sa pozrieme pozorne na prvých pár cyklov, vidíme, že v rámci základnej línie je to, čo sa deje na obrázku nižšie.

Pozadie Pozadie odkazuje na
nešpecifická hodnota fluorescencie v reakcii.Napríklad: neefektívne zhášanie fluorescencie;alebo veľký počet templátov dvojvláknovej DNA vďaka použitiu SYBR Green.Zložky pozadia signálu sú matematicky odstránené softvérovým algoritmom Real-Time PCR.

Signál reportéra
Reportérový signál sa týka fluorescenčného signálu generovaného SYBR Green alebo fluorescenčne značenými sekvenčne špecifickými sondami počas Real-Time PCR.

Normalizovaný reportérsky signál (RN)
RN označuje intenzitu fluorescencie reportérového farbiva delenú intenzitou fluorescencie pasívneho referenčného farbiva meranú v každom cykle.

Pasívne referenčné farbivo
V niektorých real-time PCR,fluorescenčné farbivo ROX sa používa ako interná referencia na normalizáciu fluorescenčného signálu.Koriguje odchýlky spôsobené nepresným pipetovaním, polohou jamiek a fluktuáciou fluorescencie na báze jamky po jamke.

Prah fluorescencie (prah)
bola upravená nad hodnotu pozadia a výrazne pod hodnotu plató amplifikačnej krivky.Musí ležať v lineárnej oblasti amplifikačnej krivky, čo predstavuje log-lineárny rozsah detekcie PCR.Prahové hodnoty by sa mali nastaviť v zobrazení log-amplifikačnej krivky, aby bola logaritmická lineárna fáza PCR ľahko identifikovateľná.Ak je v real-time PCR viacero cieľových génov, prah musí byť nastavený pre každý cieľ.Vo všeobecnosti sa ako signál fluorescenčného pozadia používa fluorescenčný signál prvých 15 cyklov PCR reakcie a prah fluorescencie je 10-násobok štandardnej odchýlky fluorescenčného signálu prvých 3 až 15 cyklov PCR a prah fluorescencie sa nastavuje v exponenciálnej fáze amplifikácie PCR.Vo všeobecnosti má každý prístroj pred použitím nastavený prah fluorescencie.

Prahová hodnota cyklu (CT) alebo bod prechodu (CP)
Cyklus, v ktorom amplifikačná krivka prekročí prah (tj bod, v ktorom sa výrazne zvyšuje detekcia fluorescencie).CT môže byť zlomok a možno vypočítať množstvo východiskovej šablóny.Hodnota CT predstavuje počet cyklov, keď fluorescenčný signál v každej skúmavke PCR dosiahne nastavený prah.Existuje lineárny vzťah medzi hodnotou CT každej šablóny a logaritmom počiatočného čísla kópie šablóny,čím vyšší je počiatočný počet kópií, tým menšia je hodnota CT a naopak.Štandardná krivka môže byť vytvorená pomocou štandardu so známym počiatočným počtom kópií, kde x x predstavuje hodnotu CT a ordináta predstavuje logaritmus počiatočného počtu kópií.Preto, pokiaľ sa získa hodnota CT neznámej vzorky, počiatočný počet kópií vzorky sa môže vypočítať zo štandardnej krivky.

Hodnota ΔCT
Popisuje hodnota ΔCTrozdiel medzi cieľovým génom a zodpovedajúcou hodnotou CT endogénneho referenčného génu, ako je napríklad housekeeping gén, a používa sa na normalizáciu množstva použitého templátu:
⇒ΔCT = CT (cieľový gén) – CT (endogénny referenčný gén)

Hodnota ΔΔCT
Hodnota ΔACT popisuje rozdiel medzi strednou hodnotou ΔACT sledovanej vzorky (napr. stimulované bunky) a priemernou hodnotou ΔACT referenčnej vzorky (napr. nestimulované bunky).Referenčná vzorka sa tiež nazýva kalibračná vzorka a všetky ostatné vzorky sa na túto relatívnu kvantifikáciu normalizujú:
⇒ΔΔCT = priemerná ΔCT (vzorka záujmu) – priemerná ΔCT (referenčná vzorka)

Endogénne referenčné gény (endogénne referenčné gény)
Úrovne expresie endogénnych referenčných génov, ako sú napríklad gény pre údržbu (housekeeping gény), sa medzi vzorkami nelíšia.Porovnanie hodnôt CT referenčného génu s cieľovým génom umožňuje normalizáciu úrovne expresie cieľového génu na množstvo vstupnej RNA alebo cDNA (pozri časť o hodnotách ΔCT vyššie).

Vnútorné referenčné gény správne premožná degradácia RNA alebo prítomnosť enzýmových inhibítorov vo vzorkách RNA, ako aj variácie v obsahu RNA, účinnosť reverznej transkripcie, získavanie nukleových kyselín a manipulácia so vzorkami.Aby sme vybrali optimálny referenčný gén (gény), upravili sme algoritmus tak, aby umožnil výber optimálnej referencie v závislosti od experimentálneho nastavenia.

Vnútorná kontrola
Kontrolná sekvencia, ktorá je amplifikovaná v rovnakej reakcii ako cieľová sekvencia a testovaná inou sondou (tj vykonaním duplexnej PCR).Interné kontroly sa často používajú na vylúčenie neúspešných amplifikácií, napríklad keď nie je detekovaná cieľová sekvencia.
Kalibračná vzorka
Referenčná vzorka (napríklad purifikovaná RNA z bunkovej línie alebo tkaniva) použitá v relatívnej kvantifikácii na porovnanie všetkých ostatných vzoriek na určenie relatívnej úrovne expresie génu.Kalibračná vzorka môže byť akákoľvek vzorka, ale zvyčajne je to kontrola (napríklad neošetrená vzorka alebo vzorka z času nula experimentu).

Pozitívne kontroly
použiť kontrolné reakcie sznáme množstvá šablóny.Pozitívne kontroly sa často používajú na kontrolu, či sada primérov alebo sada primérov-sonda funguje správne a či je reakcia nastavená správne.

Bez kontroly šablón (NTC)
Kontrolná reakcia, ktorá obsahuje všetky potrebné zložky amplifikačnej reakcie okrem templátu, ktorý sa zvyčajne nahrádza vodou.Použitie NTC môže nájsť kontamináciu spôsobenú kontamináciou činidlom alebo cudzou DNA, čím sa zabezpečí autentickosť a spoľahlivosť detekčných údajov.Zosilnenie kontroly NTC indikuje kontamináciu.

Žiadna kontrola RT (NRT)
Proces extrakcie RNA môže obsahovať zvyškovú genómovú DNA, ktorá je mimoriadne škodlivá a je vinníkom ovplyvňujúcim kvalitu údajov a prirodzeným nepriateľom qPCR, takže pri navrhovaní experimentov musí byť navrhnutý tak, aby iba amplifikoval detekciu RNA.Existujú dva spôsoby, jeden je navrhnúť priméry naprieč intróny, druhý je úplne odstrániť DNA, ktorý je lepší, o čom sa bude diskutovať neskôr.Kontrola NTR je magické zrkadlo na detekciu znečistenia DNA.Ak dôjde k zosilneniu, znamená to znečistenie.

Normy
Štandardy sú vzorky so známou koncentráciou alebo počtom kópií, ktoré sa používajú na zostavenie štandardnej krivky.Aby sa zabezpečila stabilita štandardu, génový fragment sa zvyčajne klonuje do plazmidu a používa sa ako štandard.

Štandardná krivka
sa zvyčajne zriedi do najmenej 5 koncentračných gradientov so štandardným produktom podľa pomeru zdvojnásobenia a 5 bodov je nakreslených v súradniciach hodnoty CT a počtu kópií a body sú spojené tak, aby vytvorili čiaru na vytvorenie štandardnej krivky.Pre každú štandardnú krivku je potrebné skontrolovať jej platnosť.Hodnota sklonu spadá medzi –3,3 a –3,8 a každá koncentrácia sa vykoná trikrát.Body, ktoré sa výrazne líšia od ostatných bodov, by sa mali vyradiť.Hodnota CT vzorky, ktorá sa má testovať, sa prenesie do štandardnej krivky a môže sa vypočítať hladina expresie vzorky, ktorá sa má testovať.

Hodnota CT testovanej vzorky sa prenesie do štandardnej krivky a môže sa vypočítať počiatočný počet kópií vzorky, ktorá sa má testovať.

Účinnosť a sklon
Sklon štandardnej krivky predstavuje účinnosť PCR v reálnom čase.
·Sklon -3,322 znamená, že účinnosť amplifikácie PCR je 1 alebo 100 % efektívna a množstvo produktu PCR sa v každom cykle zdvojnásobí.
·Sklon menší ako –3,322 (napr. –3,8) indikuje účinnosť PCR
·Sklon väčší ako –3,322 (napr. –3,0) naznačuje, že účinnosť PCR sa zdá byť vyššia ako 100 %, čo je zvláštne, ako by jeden cyklus PCR mohol generovať viac ako dvojnásobok amplifikovaného produktu?Táto situácia nastáva v nelineárnej fáze PCR reakcie, to znamená, že existuje veľké množstvo nešpecifickej amplifikácie.

krivka topenia
Po dokončení amplifikácie qPCR sa produkt PCR zahreje.Ako teplota stúpa, dvojvláknový amplifikačný produkt sa postupne topí, čo vedie k zníženiu intenzity fluorescencie.Po dosiahnutí určitej teploty (Tm) sa roztopí veľké množstvo produktov.Fluorescencia prudko klesá.Rôzne produkty PCR majú rôzne hodnoty Tm a rôzne teploty topenia, takže je možné identifikovať špecifickosť PCR.

Krivka topenia (odvodená krivka)
Krivka topenia je odvodená tak, aby vytvorila mapu píku, ktorá môže intuitívnejšie zobraziť situáciu fragmentov produktu PCR.Keďže teplota topenia je hodnota Tm fragmentu DNA, možno posúdiť niektoré parametre, ktoré ovplyvňujú hodnotu Tm fragmentu DNA, ako je veľkosť fragmentu, obsah GC atď.dĺžka amplifikovaného produktu je v rozsahu 80-300 bp, takže teplota topenia by mala byť medzi 80 °C a 90 °C.

Interpretácia krivky topenia: Ak sa jediný hlavný pík objaví medzi 80°C-90°C, znamená to, že fluorescenčná kvantitatívna PCR je dokonalá;ak sa hlavný pík objaví medzi 80 °C až 90 °C a rôzne píky sa objavia pod 80 °C, v zásade sa berie do úvahy primérový dimér.Môžete sa pokúsiť zvýšiť teplotu žíhania, aby ste to vyriešili;ak sa hlavný pík objaví medzi 80°C-90°C a rôznorodý pík sa objaví znova, keď teplota stúpne, v zásade sa predpokladá, že došlo ku kontaminácii DNA a DNA je potrebné odstrániť v počiatočnej fáze experimentu.

Samozrejme, stále existujú nejaké abnormálne situácie, ktoré budú nižšie popísané.
3. Pokročilé znalosti

Ak chcete urobiť qPCR, musím povedať MIQE,Minimálne informáciena zverejnenieKvantitatívnePCR v reálnom časeExperimenty — minimum informácií na publikovanie článkov o kvantitatívnej PCR v reálnom časeexperimenty .Aby sme všetkým zjednodušili pochopenie, zjednodušíme kľúčový obsah.

Originálny text MIQE si môžete vyhľadať na internete a najdôležitejšie je, že stanovujekontrolný zoznam údajov, ktorý je potrebné poskytnúť pri publikovaní článku .

Recenzenti môžu posúdiť kvalitu experimentu prečítaním týchto podrobností;budúci čitatelia to môžu použiť aj na zopakovanie alebo zlepšenie experimentu.
Stojí za zmienku, že v tomto zozname je dôležitosť každého zoznamu označená E alebo D.Čo to znamená?E: základné informácie (treba predložiť);D: žiaduce informácie (poskytnite čo najviac).

MIQE (1) – experimentálny dizajn
Mnohí šmejdi, ktorí po skončení postgraduálneho štúdia ukončili obhajobu, nebudú vedieť samostatne navrhnúť experiment, otvoriť si zošity a urobiť to, čo im učiteľ povie.Výsledkom bolo, že experimentálny dizajn nebol dôsledný a redakcia časopisu povedala, že chceli vymyslieť tento a ten obrázok, a tak to urobili ako zmätení.Takto sa robia šmejdi!

Bližšie k domovu je prvým princípom experimentu určiťprísnosť experimentálnej logiky.Najzásadnejší je dizajn experimentu a na dizajne experimentu je najdôležitejšie, ako nastaviť cieľovú vzorku, referenčnú vzorku (kontrolu) a počet opakovaní, aby boli experimentálne dáta referenčné, porovnateľné a presvedčivé.

Cieľová vzorkasa vzťahuje na vzorku, ktorá vyžaduje, aby sme po určitom ošetrení detekovali cieľový gén.Referenčná vzorkaje vzorka bez akejkoľvek úpravy, ktorá sa v biológii často označuje ako divoký typ.

Experimentálne replikáciesú veľmi dôležité.Vo všeobecnosti musí byť počet presvedčivých opakovaní vyšší ako tri.Je potrebné rozlišovať, čo je biologická replikácia a čo technická replikácia.

Biologické replikáty: Rovnaký overovací experiment vykonaný s rôznymi materiálmi (čas, rastliny, šarže, reakčné platne).

Biologická duplikácia
Vezmime si ako príklad pesticídnu úpravu korenia.Chceme nastriekať pesticídy na tri rastliny ABC, potom sú tri rastliny ABC tri biologické replikáty a ide o rovnaký overovací experiment vykonaný s rôznymi materiálmi.Ale ako experiment je určite potrebná kontrola, takže môžeme postriekať jednu z vetiev rastliny A, aby sme vytvorili experimentálnu skupinu rastliny A, a nestriekať ostatné vetvy rastliny A, aby sme vytvorili kontrolnú skupinu.Urobte to isté pre B a C.

Technické repliky (technické repliky): Ide o opakovaný experiment navrhnutý tak, aby sa predišlo chybám spôsobeným prevádzkou, čo je v skutočnosti duplicitná diera v tom istom materiáli.Ošetrenia aj kontroly musia mať nastavenia opakovania (minimálne tri) cieľového génu a interného referenčného génu.

Technické opakovanie
Zoberme si ako príklad opäť papriku ošetrenú pesticídmi.Pre experimentálnu skupinu rastliny A sme vytvorili tri diery PCR 1, 2 a 3 pre jej cieľový gén a interný referenčný gén, aby sme po detekcii získali priemer.Na kontrolu rastlín sa skupiny A tiež ošetrujú rovnakým spôsobom.Podobne urobte rovnaké ošetrenie pre rastliny B a C.Toto je technické opakovanie.

Stojí za zmienku, žeto, čo vstupuje do štatistiky, je biologické opakovanie a technické opakovanie má testovať, či sa v experimentálnom procese nevyskytujú nejaké náhodné javy, aby boli výsledky experimentu dôveryhodné, to znamená, aby sa predišlo chybám tým, že sa vezme ich priemer, ako často hovoríme.

Negatívne kontroly – NTC a NRT
NTC (kontrola bez šablóny), kontrola bez šablóny, sa používa na overenie, či je experimentálny materiál kontaminovaný.Vo všeobecnosti sa ako šablóna používa voda.Ak dôjde k fluorescenčnej reakcii, znamená to, že v laboratóriu došlo ku kontaminácii nukleovými kyselinami.

Tieto znečistenia pochádzajú z: nečistej vody, nekvalifikovaných činidiel obsahujúcich endogénnu DNA, znečistenia primérmi, znečistenia laboratórnych zariadení, znečistenia aerosólmi atď., Je potrebné použiť lapače RNázy a inhibítory RNázy.Najťažšie sa hľadá znečistenie aerosólom.Predstavte si, že vaše laboratórium je ako smog s rôznymi nukleovými kyselinami suspendovanými vo vzduchu.

NRT (No-Reverse Transkriptase), kontrola bez reverznej transkripcie, je nereverzne transkribovaná RNA ako negatívna kontrola, ktorá je kontrolou zvyšku gDNA.

Pri génovej expresii sa množstvo RNA deteguje detekciou množstva cDNA po reverznej transkripcii.Ak pri purifikácii RNA existuje zvyšok gDNA, spôsobí to chyby v experimentálnych výsledkoch, pretože aktuálne získané výsledky sú gDNA a cDNA.Na agregovanej úrovni, nielen cDNA, je potrebné počas extrakcie RNA úplne odstrániť gDNA.

MIQE (2) — vzorová informácia
Takzvané vzorové informácie znamenajú, že keď publikujeme článok o qPCR, musíme vzorové informácie jasne vysvetliť, čo je nevyhnutná súčasť článku.Podobne, keď spracovávame vzorky, musíme tiež regulovať naše vlastné operácie, aby sme zabezpečili platnosť vzoriek.

Popis vzorky je len výsledok a počas celého experimentu by sme mali venovať väčšiu pozornosť odobratým materiálom.

Výber experimentálnych materiálov
Vzorky krvi – vyberte čerstvú krv, maximálne 4 hodiny.Vzorky buniek – vyberte odber čerstvých buniek v období intenzívneho rastu.Živočíšne tkanivo – vyberte si čerstvé, energicky rastúce tkanivo.Rastlinné tkanivo – Vyberte si čerstvé, mladé tkanivo.

Určite ste si všimli, že v týchto pár vetách je kľúčové slovo: čerstvé .
Pre vyššie uvedené vzorky je najlepšou, cenovo výhodnou a stabilnou súpravou na trhu súprava Foregene, ktorá dokáže rýchlo a jednoducho extrahovať ich DNA a RNA.

Krvná DNA mini súprava

Súprava na izoláciu celkovej RNA buniek

Súprava na izoláciu zvieracej celkovej RNA

Súprava na izoláciu rastlinnej celkovej RNA

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Súprava na izoláciu rastlinnej DNA

Skladovanie experimentálnych materiálov
Vo všeobecnosti neodporúčame skladovať vzorky, ak to podmienky dovoľujú.Existuje však veľa priateľov, ktorí nemôžu vykonávať experimenty ihneď po odbere vzoriek, a niektorí dokonca potrebujú nosiť nádrže s tekutým dusíkom na pole na odber vzoriek.

Pre tohto druhu pracovitého priateľa môžem povedať len toľko, že nerozumiete spotrebným materiálom pre činidlá.Teraz mnohé spoločnosti vyrábajúce spotrebné činidlá vyrábajú činidlá, ktoré môžu uchovávať vzorky RNA pri izbovej teplote a vy si ich môžete vybrať.Konvenčný spôsob skladovania je skladovanie tekutého dusíka pomocou malej nádrže na tekutý dusík, ktorá sa ľahko prenáša.Po prinesení vzorky späť do laboratória ju skladujte v chladničke -80°C.

Pri experimentoch s RNA sa musí dodržiavať princíp šiestich slov:nízka teplota, žiadne enzýmy,arýchlo .

Koncept nízkej teploty je ľahko pochopiteľný;bez enzýmov je RNáza všade vo svete, v ktorom žijeme (inak by vás zabil HIV), takže ako sa vyhnúť RNáze pri experimentoch je veľmi dôležitý koncept;rýchlo,Na svete neexistuje kung-fu, ktoré by sa nedalo prelomiť, len rýchlosť sa nedá prelomiť.

Preto v istom zmysle platí, že čím kratší čas extrakcie, tým lepšia súprava.PrečoForegene's kit zdôrazňujú rýchlosť, pretože to dobre vedia.

PS: Niektoré dievčatá robia experimenty veľmi opatrne, ale nie sú také dobré ako slam dunk po niekoľkých rokoch práce.Majú pocit, že Boh je nespravodlivý, sťažuje sa na druhých a hľadá život.V skutočnosti tomu nerozumela.Nechránil dobre RNA a hráč slam dunk bol šikovný.Keď robil experiment, myslel si, že slam dunk dokončí s trikrát, päťkrát a dvoma deleniami, ale experiment urobil dobre.

Poznámka: Pomalšie, väčšie šance na inváziu RNázy.Ako sa vycvičiť, aby ste boli rýchly?Neexistuje žiadny spôsob, len viac cvičiť.

Pre rôzne experimenty a rôzne vzorky je stále potrebné čítať viac literatúry a zvoliť vhodnú metódu spracovania.Pre proces zberu a skladovania vzoriek MIQE vyžaduje, aby to bolo jasne napísané v papieri, aby recenzenti mohli skontrolovať spoľahlivosť papiera a pre ohromených mladých ľudí je tiež vhodné zopakovať váš experiment.

Aj keď sú biologické experimenty ťažké, sú špičkové.Ak si nedáte pozor, môžete prevrátiť svet.Napríklad premeniť SARS na biochemickú krízu alebo vyrobiť hybridnú ryžu na záchranu 1,3 miliardy ľudí.Na obrázku nižšie je chemický experiment, mali by ste pochopiť, aký hrdý ste na svoj výskum, keď sa pozriete na jeho vzhľad podobný vtákovi.Zabudni na to, nečierni ho.

MIQE (3) – extrakcia nukleových kyselín.
Extrakcia nukleových kyselín je veľká udalosť a všetky molekulárne biologické experimenty začínajú extrakciou nukleových kyselín.Najprv skopírujme obsah MIQE o extrakcii nukleových kyselín.

Pri pohľade na túto formu nemôžete zostať na povrchu.Forma je dogma.Ak chcete byť najlepším študentom, musíte sa opýtať prečo.Podstatný obsah tejto tabuľky je: Prenasledovaniečistota, integrita, konzistencia a extrakčné množstvo RNA .

Prvá časťProces alebo nástroj je krok extrakcie nukleovej kyseliny.Ak na extrakciu používate automatický extraktor nukleových kyselín (pre pokročilých, kontaktujte ma kvôli nákupu), musíte uviesť názov modelu prístroja.

Názov súpravy a

Aká súprava bola použitá na zmenu podrobností, aké špeciálne činidlá boli pridané alebo aké špeciálne operácie boli vykonané, mali by ste jasne vysvetliť, aby ostatní mohli váš experiment ľahko zopakovať.

Niektorí ľudia pri extrakcii špeciálnych vzoriek pridávajú nejaké špeciálne činidlá, mysliac si, že je to ich tajná zbraň a nehovoria to ostatným.Pri utajovaní zároveň strácajú možnosť, aby váš článok zažiaril.Nebuď múdry, musíš byť vo vedeckom bádaní úprimnejší ako starý Zhang, ak chceš byť múdry, článok ťa spraví hlúpym.

si musíte zapamätať produktové číslo súpravykeď si objednáte súpravu a napíšete článok.Na súprave sú vo všeobecnosti dve čísla: Cat – katalógové číslo (číslo produktu, číslo výrobku), Lot – číslo šarže produktu ( Používa sa na označenie šarže, z ktorej produkt pochádza).

Okrem toho sa pri objednávaní biochemických reagencií často používa CAS číslo a budem ho spoločne popularizovať.Číslo CAS je číslo, ktoré dáva Americká chemická spoločnosť každému novému chemickému lieku.Vo všeobecnosti sú tri čísla spojené pomlčkou.Rushuiovo číslo CAS: 7732-18-5.Chemikálie majú často viacero prezývok, ale číslo CAS je jedinečné.Pri objednávaní lieku si môžete najskôr skontrolovať jeho CAS číslo.

Bližšie k domovu, prečo musíme tieto veci jasne opísať?V skutočnosti ide aj o kontrolu kvality extrakcie RNA.Použitím nástrojov a súprav bude extrakcia RNA konzistentnejšia.Rozsah extrakcie bežných laboratórií nie je veľký a možno ho získať pomocou súprav.

Podrobnosti o liečbe DNázou alebo RNázou
Dôležitou otázkou fluorescenčnej kvantitatívnej PCR je zabrániť kontaminácii DNA a neexperimentovať, ak dôjde ku kontaminácii.Preto je nevyhnutné uviesť proces, ktorý ste použili na spracovanie DNA, aby ste preukázali, že DNA v experimentálnom procese bola úplne a úplne odstránená.znázornené schematickým diagramom.

Schematický diagram RNA a DNA
Vo všeobecnosti je metódou na odstránenie DNA ošetrenie RNA DNázou po extrakcii.Ide však o pomerne staré metódy.Komerčné súpravy na extrakciu RNA boli schopné odstrániť DNA počas procesu extrakcie bez pridania DNázy.Napríklad séria súprav od Foregene.

Poznámka: Odstránenie DNA počas extrakcie RNA je veľmi nebezpečný dvojsečný meč, ktorý predĺži operačný čas extrakcie RNA a zvýši riziko degradácie RNA.V podstate ide o kompromis medzi výťažkom RNA a čistotou.

Navyše množstvo DNázy pridanej do adsorpčnej kolóny na báze oxidu kremičitého je veľmi malé a na dosiahnutie účinku je potrebné použiť vysokokvalitnú DNázu.Neoptimalizovanú DNázu nemožno rýchlo a úplne stráviť.Ide o test technickej úrovne obchodníka.Samozrejme, existujú ešte čudnejší obchodníci, ktorí sa chvália, že DNA sa dá odstrániť aj bez DNázy.Dá sa povedať, že každý, kto sa chváli, že DNA sa dá úplne odstrániť bez DNázy, je chuligán.DNA je relatívne stabilná dvojvláknová štruktúra a nedá sa vymazať len rozprávaním a smiechom.

Hodnotenie kontaminácie
metóda hodnotenia: detekcia elektroforézou, 1% agaróza, 6V/cm, 15min, zaťaženie 1-3 ul

Kvantitatívna analýza nukleových kyselín
sa zvyčajne meria pomocou UV spektrofotometra.Dovoľte mi najprv popularizovať význam troch hodnôt OD260, OD280 a OD230.
·OD260nm: Je to absorpčná vlnová dĺžka najvyššieho absorpčného vrcholu nukleovej kyseliny a najlepšia nameraná hodnota sa pohybuje od 0,1 do 1,0.Ak nie, zrieďte alebo koncentrujte vzorku, aby ste ju dostali do rozsahu.
·OD280nm: Je to absorpčná vlnová dĺžka najvyššieho absorpčného vrcholu bielkovín a fenolových látok.
·OD230nm: Je to absorpčná vlnová dĺžka najvyššieho absorpčného vrcholu sacharidov.

Ďalej si povedzme o úlohe každého ukazovateľa.Pre A260 sa môže použiť na meranie výťažku nukleovej kyseliny.Keď OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Pre čistotu sa musíme pozrieť na pomery, ktoré bežne vidíme: OD260/280 a OD260/230.
· Čistá DNA: OD260/280 sa približne rovná 1,8.Keď je väčšia ako 1,9, znamená to, že existuje znečistenie RNA, a keď je menšia ako 1,6, znamená to, že dochádza k znečisteniu proteínmi a fenolmi.
· Čistá RNA: 1,7
·OD260/230: Či už ide o DNA alebo RNA, referenčná hodnota je 2,5.Ak je nižšia ako 2,0, znamená to, že došlo k znečisteniu cukrom, soľou a organickou hmotou.

Integrita RNA

Je veľmi dôležité merať integritu RNA.Vo všeobecnosti je potrebné urobiť experiment s denaturačným gélom RNA, aby sa skontrolovalo, či je jas medzi 28S a 18S RNA dvojnásobný vzťah.Keď sa objaví tretí pás 5S, znamená to, že RNA začala degradovať, s výnimkou bezstavovcov.

Údaje pre hodnotenie kvality RNA: Okrem vyššie uvedených testov existujú aj niektoré pokročilejšie prístrojové testy z hľadiska integrity RNA, ako napríklad test integrity RQI systému automatickej elektroforézy Experion, ktorý dokáže zistiť, či je RNA degradovaná neviditeľne.

Vo vedeckom výskume predstavuje fluorescenčná kvantitatívna PCR porovnanie medzi cieľovým génom a interným referenčným génom.Preto v procese uchovávania vzorky RNA, extrakcie RNA atď. je primárnym cieľom zabezpečiť integritu RNA.

Ako integrita RNA ovplyvňuje rovnováhu medzi cieľovým génom a interným referenčným génom, možno ľahko pochopiť z obrázku nižšie.Degradácia povedie k neúplnosti génu, či už ide o nekompletnosť interného referenčného génu alebo nekompletnosť cieľového génu, bude to mať veľký vplyv na dáta.

Schematický diagram cieľového génu a referenčného génu nesmie byť pravdivý

Inhibičný test (či je hodnota CT potlačená pri vysokej alebo nízkej koncentrácii alebo iných podmienkach)

Ak vezmeme tento obrázok ako príklad, hodnoty Ct piatich kriviek sú nasledovné.Rozloženie hodnôt CT medzi krivkami je nerovnomerné a hodnoty Ct sú oneskorené pri vysokých a nízkych koncentráciách, čo je prípad inhibície PCR.

Kľúčový bod: V procese extrakcie RNA musíme opustiť mylné predstavy a vytvoriť tie správne.

Nesprávna myšlienka je: extrakcia RNA sleduje iba výťažok, mysliac si, že čím väčšie množstvo získanej RNA, tým lepšie.V skutočnosti, keď robíme kvantifikáciu, ak počet génov nie je príliš veľký, nepotrebujeme veľa RNA.Množstvo extrahovanej RNA je viac než dostatočné.

Správny koncept je:Extrakcia RNA by mala sledovať čistotu, integritu a konzistenciu.Čistota môže zabezpečiť, že následná reverzná transkripcia nebude inhibovaná a údaje nebudú ovplyvnené DNA.Integrita zabezpečuje rovnováhu cieľových sekvencií a interných referencií.Konzistencia zaisťuje stabilné zaťaženie vzorky.

MIQE (4) – reverzná transkripcia
Mylná predstava: snaha o väčší objem vzorky.
Správna koncepcia: Usilujte sa o konzistenciu (stabilitu), bez ohľadu na množstvo nanesenej RNA, účinnosť reverznej transkripcie zostáva konzistentná, čo zabezpečuje, že rozdiely v cDNA môžu skutočne odrážať rozdiely v mRNA.
Tento proces vysvetľujeme schematickým diagramom:

Schematický diagram účinnosti reverznej transkripcie, nie je pravdivý
V prvom rade musíme pochopiť rozdiel medzi procesom reverznej transkripcie a procesom PCR.PCR podlieha viacnásobným procesom zahrievania a žíhania a cieľový fragment rastie exponenciálne;zatiaľ čo reverzná transkripcia nemá tento proces, môžeme si predstaviť, že reverzná transkripcia je v skutočnosti jedna k jednej. Počas procesu replikácie sa toľko kusov RNA

keďže je možné získať toľko kúskov informácií o cDNA, už by to malo byť pochopené, pretože veľké a malé fragmenty boli spätne prepísané a nie je možné zamerať sa na jeden fragment.A pretože množstvo RNA je relatívne malé, množstvo získanej cDNA je tiež relatívne malé, na rozdiel od PCR, ktorá má amplifikačný efekt, takže sa v podstate nedá zistiť.

Výsledky elektroforézy cDNA
Po druhé, v ideálnom prípade sa reverzná transkripcia vykonáva jedna ku jednej, ale žiadna reverzná transkriptáza od žiadnej spoločnosti nemôže dosiahnuť tento účinok.V zásade sa účinnosť väčšiny reverzných transkriptáz pohybuje medzi 30-50%.Ak je to tak, radšej by sme mali relatívne stabilnú účinnosť reverznej transkripcie, čo chceme vidieť na obrázku: 3 RNA získajú 2 cDNA, 6 RNA získa 4 cDNA, takže bez ohľadu na to, koľko vzorky je nanesené, účinnosť reverznej transkripcie je relatívne stabilná.Nechceme vidieť situáciu, keď je účinnosť reverznej transkripcie nestabilná a vysoká koncentrácia je inhibovaná.

Ako teda overiť, či je účinnosť reverznej transkripcie stabilná?Metóda je veľmi jednoduchá, stačí urobiť porovnávací test: jedným je reverzná transkripcia do cDNA po dvojnásobnom zriedení RNA a druhá je urobiť dvojité riedenie po reverznej transkripcii do cDNA a potom vykonať qPCR, aby ste videli získaný sklon Je to konzistentné.Ako špičkový študent by ste to mali pochopiť za pár sekúnd.Ako je ukázané nižšie:

Riedenie RNA a cDNA na testovanie, či je účinnosť reverznej transkripcie stabilná
Reverzná transkriptáza a súprava
Ako môže mať perfektná fluorescenčná kvantitatívna PCR vynikajúcu reverznú transkriptázu a súpravu.Reverzná transkriptáza sa zhruba delí na dva typy podľa zdroja, AMV respM-MLVa ich výkon je rovnaký ako v tabuľke.

Aktivita RNázy H
RNáza H je ribonukleáza H, čínsky názov je ribonukleáza H, čo je endoribonukleáza, ktorá dokáže špecificky hydrolyzovať RNA v hybridnom reťazci DNA-RNA.RNáza H nemôže hydrolyzovať fosfodiesterové väzby v jednovláknovej alebo dvojvláknovej DNA alebo RNA, to znamená, že nedokáže stráviť jednovláknovú alebo dvojvláknovú DNA alebo RNA.Bežne sa používa pri syntéze druhého vlákna cDNA.

Je to zvláštna vec.Hovoríme, že reverzná transkriptáza má aktivitu RNázy H, nie že reverzná transkriptáza obsahuje RNázu H a nemusí byť možné oddeliť RNázu H od reverznej transkriptázy, možno kvôli konformácii určitých skupín v reverznej transkriptáze. Táto aktivita je spôsobená reverznou transkriptázou.

Preto, bez ohľadu na vyššiu účinnosť reverznej transkripcie AMV, jej aktivita RNázy H znižuje výťažok cDNA.Samozrejme, výrobcovia činidiel neustále optimalizujú svoje produkty, aby čo najviac eliminovali aktivitu RNázy H v reverznej transkriptáze, aby sa zvýšil výťažok cDNA.
Teplota žíhania

Sekundárna štruktúra RNA pri rôznych teplotách
Pozrite si obrázok vyššie pre sekundárnu štruktúru RNA pri rôznych teplotách a použite online nástroj mFold na určenie sekundárnej štruktúry cieľového fragmentu za špecifických podmienok teploty a koncentrácie soli.Pri 55 °C je sekundárna štruktúra RNA stále veľmi zložitá, reverzná transkriptáza nemôže fungovať a sekundárna štruktúra nemôže byť úplne rozlíšená do 65 °C, pričom optimálna teplota AMV a M-MLV je oveľa nižšia ako táto teplota.
čo robiť?Sekundárna štruktúra je komplementárne párovanie samotného templátu, čo vedie k silnej konkurencii medzi primérom a reverznou transkriptázou a templátom, čo vedie k sérii problémov, ako je nízka E a slabá opakovateľnosť.

čo robiť?Len čo najviac zvyšujte teplotu žíhania .

Mnoho výrobcov činidiel zlepšuje svoju reverznú transkriptázu prostredníctvom genetického inžinierstva.Niektoré zvyšujú reakčnú teplotu, ako napríklad Jifan a Aidelai, a niektoré odstraňujú aktívnu skupinu enzýmu RNázy H, aby sa zlepšila afinita medzi enzýmom a templátom RNA.Vysoká afinita môže kompetitívne vytlačiť sekundárnu štruktúru a plynule ju prečítať a tiež výrazne zlepšiť účinnosť reverznej transkripcie.
Kľúčový bod: Reverzná transkripcia je dôležitejšia pre dosiahnutie konzistentnosti účinnosti reverznej transkripcie (enzýmy musia byť nielen účinné, ale aj stabilné), a nie množstvo nanesenej vzorky, ak nepôjde o obzvlášť rozsiahlu fluorescenčnú kvantitatívnu PCR, nebude to vôbec možné.Viacnásobné cDNA.
Rôzni výrobcovia tiež vynaložili určité úsilie na dosiahnutie konzistentnosti.Napríklad väčšina spoločností teraz zabalila reverzný prepis ako štandardnú súpravu na predaj, čo je dobrá voľba.
Napríklad súpravy Foregene RT Easy Series:

RT Easy I (Master premix pre súpravu na syntézu prvého vlákna cDNA)

MIQE (5) – informácia o cieľovom géne

Vyššie uvedený obrázok vysvetľuje
1. Či je tento gén účinný pri opakovaných experimentoch, možno vo všeobecnosti overiť opakovanými experimentmi.
2. Gene ID, viete.
3. Dĺžka génu, celková dĺžka cieľového génu určite nie je problém.Pri navrhovaní primerov sa uistite, že dĺžka amplikónu je medzi 80-200 bp, aby sa zabezpečila lepšia účinnosť amplifikácie.
4. Informácie o porovnaní sekvencie Blast, cieľový gén je potrebné porovnať v génovej banke, aby sa zabránilo nešpecifickej amplifikácii.
5. Prítomnosť pseudogénov.Pseudogén je sekvencia DNA podobná normálnemu génu, ale stráca svoju normálnu funkciu.Často existuje v multigénovej rodine eukaryotov.Zvyčajne je reprezentovaný ψ.Je to nefunkčná kópia genómovej DNA v genóme, ktorá je veľmi podobná sekvencii kódujúceho génu., sa vo všeobecnosti neprepisujú a nemajú jasný fyziologický význam.
6. Poloha primérov vzhľadom na exóny a intróny.V prvých rokoch, keď sme riešili problém kontaminácie DNA, sme často venovali pozornosť pozíciám primérov, exónov a intrónov a vo všeobecnosti sme zvažovali navrhnutie primérov naprieč intrónmi, aby sme sa vyhli amplifikácii DNA.Pozrite si obrázok nižšie: čierna predstavuje intróny, rôzne modré predstavujú exóny, ružová predstavuje bežné priméry a svetločervená predstavuje priméry preklenujúce intróny.

Schematické, nikdy nie pravda
Zdá sa to ako dokonalý plán, ale v skutočnosti vo väčšine prípadov trans-intrónové primery nie sú také magické, ako si predstavovali, a tiež spôsobia nešpecifickú amplifikáciu.Takže najlepší spôsob, ako zabrániť kontaminácii DNA, je úplne odstrániť DNA.
7. Predikcia konformácie.Pomocou tohto príkladu znova použite online nástroj mFold na určenie sekundárnej štruktúry cieľového fragmentu pri špecifickej teplote a koncentrácii soli.

Sekundárna štruktúra RNA pri rôznych teplotách
Sekundárna štruktúra je komplementárne párovanie samotného templátu, čo povedie k silnej konkurencii medzi párovaním priméru a templátu a šanca na väzbu priméru je menšia, čo vedie k sérii problémov, ako je nízka E a slabá opakovateľnosť.Prostredníctvom softvérovej predikcie, ak neexistuje problém so sekundárnou štruktúrou, by to bolo skvelé.Ak existuje, náš nasledujúci článok bude konkrétne diskutovať o tom, ako tento problém vyriešiť.

MIQE (6) — qPCR oligonukleotidy

Pri fluorescenčnej kvantitatívnej PCR je prvou vecou, ​​s ktorou každý deň bojujete, extrakcia RNA a druhou vecou môže byť návrh priméru.
Predovšetkým stále kontrolujeme pravidlá návrhu základného náteru podľa kontrolného zoznamu MIQE.Je to také jednoduché, že sa eštebáci môžu smiať a môžeme to ukončiť jednou vetou: zistiť poradie a polohu primérovej sondy a spôsob modifikácie.Pre metódu purifikácie primérov je syntéza primérov v súčasnosti taká lacná, qPCR si zaslúži purifikačné metódy PAGE a vyššie a informácie o nástroji syntézy nie sú dôležité.Mnoho ľudí robí priméry celé desaťročia a nevedia, že syntetizátor je ABI3900.
Čo sa týka princípov návrhu primérov, nemusíte sa ich naspamäť učiť naspamäť, pretože väčšina softvérov na navrhovanie primérov alebo online nástrojov sa o tieto problémy dokáže postarať (odporúčaný online nástroj primer3.ut.ee/) a 99,999 % navrhovania primérov sa nevykonáva ručne Pozrite sa, autor niekedy navrhuje stovky primérov denne, ak si prečítate jeden po druhom, bude to neznesiteľné.
Po vytvorení základných náterov skontrolujte nasledujúce body:
1. Navrhnite priméry blízko 3' konca: V prípade použitia oligo dT primérov na syntézu prvého vlákna cDNA, berúc do úvahy účinnosť reverznej transkripcie a integritu RNA, navrhnuté priméry musia byť navrhnuté blízko 3' konca, aby sa zlepšila účinnosť amplifikácie.Na vysvetlenie použite nasledujúci obrázok (neexistuje spôsob, ako to pochopiť):

Prečo by mali byť primery navrhnuté blízko 3′ konca, to nemusí byť pravda
2. Hodnota TM: Hodnota Tm je pri 55-65°C (pretože exonukleázová aktivita je najvyššia pri 60°C) a obsah GC je 40%-60%.
3. BLAST: Aby sa predišlo nešpecifickej amplifikácii genómu, musí sa na dodatočné overenie použiť Blast.

MIQE(7)—proces qPCR

1. Súprava qPCR
Podľa požiadaviek MIQE musíme v článku jasne popísať kompletné reakčné podmienky vrátane konfigurácie reakčného systému PCR, aký kit sa používa, kto je výrobca, aký veľký je reakčný systém, či sa používa farbiaca metóda alebo sondová metóda, nastavenia programu PCR.Vodiči veteránov určite zistia, že pokiaľ je súprava vybraná, vyššie uvedené informácie sú v podstate určené.
V súčasnosti je výroba a výroba fluorescenčných kvantitatívnych PCR súprav veľmi vyspelou technológiou.Pokiaľ si nevyberiete extrémne zlých výrobcov, pravdepodobnosť problémov nie je vysoká, no aj tak sa s vami chceme podeliť o niekoľko bodov:
Enzým Taq s horúcim štartom:Najdôležitejšou časťou PCR je hot-start Taq enzým.Enzýmy horúceho štartu na trhu sa vo všeobecnosti delia na dva typy, jeden je chemicky modifikovaný enzým horúceho štartu (môžete si to predstaviť ako zaliatie parafínom) a druhý je enzým horúceho štartu na modifikáciu protilátok (väzba antigén-protilátka).Chemická modifikácia je skorý spôsob horúcich štartovacích enzýmov.Keď sa dosiahne určitá teplota, enzým uvoľní svoju aktivitu.Protilátkou modifikovaný enzým horúceho štartu využíva biologické metódy na blokovanie aktivity enzýmu.Keď sa dosiahne určitá teplota, protilátka sa denaturuje a inaktivuje ako proteín a do hry vstúpi aktivita enzýmu.

Aké je však využitie tohto?Je to tak, uvoľňovacia aktivita enzýmov modifikovaných protilátkou je rýchlejšia ako u chemicky modifikovaných enzýmov, takže z hľadiska citlivosti majú enzýmy modifikované protilátkou miernu výhodu, takže v súpravách na trhu v podstate žiadne chemicky modifikované enzýmy nie sú.Ak existuje, potom technológia tohto výrobcu stále uviazla v ére milénia.
Koncentrácia horčíkových iónov:Koncentrácia horčíkových iónov je pri PCR reakcii veľmi dôležitá.Vhodná koncentrácia horčíkových iónov môže podporiť uvoľnenie aktivity enzýmu Taq.Ak je koncentrácia príliš nízka, aktivita enzýmu sa výrazne zníži;ak je koncentrácia príliš vysoká, enzýmom katalyzovaná nešpecifická amplifikácia sa zvýši.Koncentrácia horčíkových iónov tiež ovplyvní žíhanie primérov, teplotu topenia templátu a produktov PCR, čím ovplyvní výťažok amplifikovaných fragmentov.Koncentrácia horčíkových iónov je všeobecne kontrolovaná na 25 mM.Samozrejme, pre dobrý kit musí byť koncentrácia horčíkových iónov dobre kontrolovaná.Niektorí obchodníci pridávajú do činidla chelatačné činidlo pre horčíkové ióny, čím sa dá dosiahnuť efekt automatickej úpravy koncentrácie horčíkových iónov.
Koncentrácia fluorescenčného farbiva:Fluorescenčné farbivo, čo je zelená SYBR, ktorú zvyčajne používame, generuje fluorescenciu hlavne väzbou na vedľajšiu drážku dvojvláknovej DNA, pretože väzba farbiva na dvojvláknovú DNA je nešpecifická, to znamená, že pokiaľ je s ňou kombinovaná dvojvláknová DNA, môže nastať fluorescencia, takže primér-diméry a templáty DNA v systéme sa s ňou spoja a vytvoria sa s ňou.
PS: Vzhľadom na vlastnosti citlivé na svetlo sú produkty na trhu vo všeobecnosti balené v hnedých nepriehľadných centrifugačných skúmavkách (ako je znázornené na obrázku nižšie).To však narazí na problém.Pri odbere vzoriek je ťažké zistiť, či je kvapalina nasávaná.V tomto ohľade je Qingke skutočne užívateľsky najpríjemnejší (ako je znázornené na obrázku nižšie) a priehľadná tuba je zabalená v nepriehľadnom plechovom vrecku.Potom ho vložte do plechového vrecka, berúc do úvahy pohodlie vyhýbania sa svetlu a odberu vzoriek.Musíte si vybrať správne číslo produktu.TSE204 je super nákladovo efektívna existencia, kvôli ktorej chcem sadiť trávu.

Veľmi dôležitá je aj koncentrácia fluorescenčného farbiva.Ak je koncentrácia príliš nízka, krivka amplifikácie sa v neskoršom štádiu nezvýši a nie je dokonalá;ak je koncentrácia príliš vysoká, spôsobí rušenie šumom.Pretože fluorescenčná kvantitatívna PCR závisí hlavne od hodnoty CT, ak koncentrácia fluorescenčného farbiva nie je správne nastavená, nízky bod je lepší ako vysoký bod.Samozrejme, najvhodnejšia je vhodná koncentrácia farbiva.

ROX: Farbivá ROX sa používajú na korekciu chýb fluorescenčného signálu medzi jamkami.Niektorí výrobcovia prístrojov vyžadujú kalibráciu, zatiaľ čo iní nie.Napríklad použitie amplifikačného prístroja Real Time PCR od Thermo Fisher Scientific zvyčajne vyžaduje kalibráciu vrátane 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus atď. Popisujú to všeobecné pokyny k súprave.
qPCR Mix od Foregene obsahuje aj farbivo ROX, ktoré je vhodné na použitie v rôznych modeloch.

Real Time PCR Kit-Taqman

Slabá úprava vodíkovými väzbami: Liečba slabých vodíkových väzieb je pomerne technická záležitosť.Nič nečítalo manuály mnohých súprav, ale žiadna z nich túto tému nespomenula.V skutočnosti je to také dôležité.Kombinácia zásad závisí najmä od sily vodíkových väzieb.Silné vodíkové väzby sú normálnou amplifikáciou a slabé vodíkové väzby vedú k nešpecifickej amplifikácii.Ak nie je možné dobre eliminovať slabé vodíkové väzby, nemožno sa vyhnúť nešpecifickej amplifikácii.V rámci autora si tento problém všimlo len niekoľko spoločností.Pri kúpe súpravy sa môžete pozrieť, či ste v tomto smere uvažovali o riešení pre súpravu, ktorú si chcete vybrať.

Reakčný objem: Bežnejšie sa používa systém 20-50ul a menšie objemy pravdepodobne spôsobia chyby.Vo všeobecnosti sa v pokynoch súpravy odporúča použiť objemy PCR reakcií.Nebuďte múdri a používajte menšie objemy, aby ste ušetrili náklady.cieľom.Objem odporúčaný obchodníkmi bol skutočne otestovaný a môže sa stať, že nedokážu vyriešiť problém chýb spôsobených malými objemami.
2. Výrobca a číslo výrobku rúrkovnice
Každý pozná princíp fluorescenčnej kvantitatívnej PCR.Zber fluorescencie sa vykonáva hlavne pomocou uzáverov skúmaviek PCR.Pri výbere spotrebného materiálu PCR venujte pozornosť dvom bodom: dobrá priepustnosť svetla a vhodná pre prístroj.Všeobecne možno povedať, že dosky a elektrónky mainstreamových značiek sú v poriadku, no treba si pozorne vyberať z hľadiska prispôsobenia, inak nástroj nebudete môcť používať.

4. Vedomosti na najvyššej úrovni

MIQE (8) — validácia qPCR
Toto je najvyššia priorita qPCR!Toľko hrdinov tu padlo do piesku.Samozrejme, je tiež možné, že máte šťastie a gény, ktoré ste študovali, sú jednoduché, takže ste sa ľadovou jaskyňou vznášali pozdĺž vetra.Overovacie informácie qPCR sú určené na testovanie spoľahlivosti údajov.Potrebné overovacie informácie uvádzame nasledovne:

1.Skúška špecifickosti
Špecifickosť amplifikácie cieľového génu sa testuje tak, že sa skontroluje, či je elektroforéznym obrazom jeden pás;overenie sekvencie;krivka topenia, aby sa zistilo, či je mapa vrcholu jednoduchá;overenie trávenia enzýmov a iné metódy.
Tu sa zameriame na tanalýza nešpecifickej amplifikácie metódou kriviek topenia.Všeobecne povedané, keď navrhujeme priméry, veľkosť fragmentu produktu sa vyžaduje v rozsahu 80-200 bp, čo robí teplotu topenia produktu PCR v rozsahu 80-85 °C.Preto, ak existujú rôzne píky, musia existovať iné nešpecifické amplifikačné produkty;ak sa pík objaví pod 80 °C, všeobecne sa považuje za primérový dimér;ak sa vrchol objaví nad 85 °C, všeobecne sa to považuje za kontamináciu DNA alebo viac nešpecifickú amplifikáciu veľkých fragmentov.
Poznámka: Niekedy je pri 80 °C len jeden vrchol.V tejto chvíli je potrebné túto koncepciu dodržiavať.Je pravdepodobné, že výsledky amplifikácie sú všetky primérové ​​diméry.

Normálna krivka topenia (jeden vrchol bez nešpecifického zosilnenia)

Problematická krivka topenia (nešpecifická amplifikácia falošných píkov)
【Analýza prípadu】

Existuje hlavný vrchol, ale dimér primeru je vážny
Krivka topenia s jedným vrcholom na obrázku nižšie môže ľahko oklamať vaše oči, pretože si myslíte, že je to dokonalý experiment, ale výsledok je úplne nesprávny.V tomto čase sa musíme pozrieť na teplotu topenia.Maximálna teplota je pod 80 °C, čo je úplne primer-dimér.

Žiadny cieľový fragment, všetky primérové ​​diméry
Tu môj brat nemôže prestať.Na obrázku nižšie je fotka urobená mobilom, ktorý mi poslal eštebák.Všetky činidlá, ktoré použil, sú bežne používané značky v priemysle.Zmenil sa z jednej značky s predponou T na inú značku s predponou T.Myslím, že ste to už uhádli.Ten darebák na mňa zakričal: „Činidlo použité na prvom obrázku je príliš dobré a vrchol je jednoduchý.Neskôr, po použití činidla, ktoré ste odporučili, to bude ako na druhom obrázku so zmiešanými vrcholmi.Urobili ste ma nešťastným.“
Oddeľte dva grafy.Jeden má na prvý pohľad jednoduchý a druhý dvojitý.Nezmysel, jediný vrchol je samozrejme v poriadku.Je to pravda?
Horšie ako Dou E, ak dám dva obrázky na obrázok nižšie, okamžite pochopíte.V skutočnosti nás tento druh obrazu ľahko paralyzuje.Po dôkladnej analýze sme zistili, že: pík na prvom obrázku je pri 75 °C, čo je úplne primérový dimér;vrchol druhého údaja sa objaví pri 75 °C a 82 °C, aspoň tam je Produkt sa objaví.

Obrázky spätnej väzby od študentov
Základným problémom teda nie je problém činidiel, ale problém návrhu primeru.Zároveň to tiež dokazuje, že niektoré veľké značky nemajú kvalitu železa, a dokazuje to aj to, čo povedal môj brat: Nie je to značka činidla, ktorá podporuje váš článok.Je to váš článok, ktorý podporil značku činidiel.Len si predstavte, že ak by ten nezbedník nevymenil činidlá, do denníka by sa poslali nesprávne údaje a to, čo by sa stalo, by bola tragédia.
2. Hodnota Ct kontroly slepého pokusu
Nevysvetľujte, ak má slepá kontrola hodnotu Ct, nie je to znečistenie?Stále však musíte pochopiť, ktorý prázdny ovládací prvok má hodnotu Ct.Ak je to NTC, znamená to, že existuje cudzia DNA, ako je kontaminácia činidlom.Ak ide o NRT, znamená to, že extrahovaná RNA má kontamináciu DNA.
3. Štandardná krivka
Vrátane sklonu a výpočtového vzorca možno pomocou vzorca vypočítať účinnosť PCR.Dokonalý experiment vyžaduje, aby sa sklon štandardnej krivky približoval k 3,32 a R² sa približoval k 0,9999.
4. Lineárny dynamický rozsah
Dynamický rozsah reakcie je lineárny.Podľa šablóny použitej na vytvorenie štandardnej krivky by dynamický rozsah mal zahŕňať aspoň 5 koncentračných gradientov a venovať pozornosť zmene hodnôt Ct pri vysokých koncentračných gradientoch a nízkych koncentračných gradientoch.
5. Presnosť detekcie
Zmeny vo výsledkoch qPCR, teda slabá opakovateľnosť, teda slabá presnosť, sú spôsobené mnohými faktormi, vrátane teploty, koncentrácie a prevádzky.S klesajúcim počtom kópií sa presnosť qPCR vo všeobecnosti stáva menej kontrolovateľnou.V ideálnom prípade v rámci experimentálnej variácie by táto technická variácia mala byť odlišná od biologickej variácie a biologické replikácie môžu priamo riešiť štatistické rozdiely vo výsledkoch qPCR medzi skupinami alebo liečbami.Najmä v prípade diagnostických testov sa musí uviesť najlepšia presnosť medzi testami (opakovateľnosť) naprieč miestami a operátormi.
6. Účinnosť detekcie a LOD (v multiplexnej qPCR)
LOD je najnižšia koncentrácia 95 % zistených pozitívnych vzoriek.Inými slovami, koncentrácia LOD obsiahnutá v sade cieľových génových replikátov by nemala presiahnuť 5 % neúspešných reakcií.Pri vykonávaní analýzy multiplexnej qPCR, najmä na súčasnú detekciu bodových mutácií alebo polymorfizmov, musí multiplexná qPCR poskytnúť dôkaz, že presnosť viacerých cieľových fragmentov nie je ohrozená v tej istej skúmavke, viacnásobná detekcia a detekcia v jednej skúmavke by mali byť rovnaké.Tomuto problému je potrebné venovať pozornosť najmä vtedy, keď sa súčasne amplifikujú cieľové gény s vysokou koncentráciou a cieľové gény s nízkou koncentráciou.
Problémy a riešeniaVo všeobecnosti sa problémy, s ktorými sa často stretávame pri ladení qPCR, zameriavajú na tieto aspekty:
·nešpecifická amplifikácia
· Ťažký výber koncentrácie primeru a problémy s primer-dimérmi
· Teplota žíhania je nepresná
· Sekundárna štruktúra ovplyvňuje účinnosť zosilnenia
nešpecifická amplifikácia
nešpecifická amplifikáciasa vyskytuje , všeobecne sa zvažuje, či nie je vhodný návrh základného náteru, ale ak sa s výmenou základných náterov neponáhľate, môžete najskôr vyskúšať nasledujúce metódy (princíp je tiež priložený):
·Zvýšte teplotu žíhania – snažte sa, aby slabé vodíkové väzby nebolo možné udržať;
·Skrátiť čas žíhania a predĺženia – znížiť možnosť slabých vodíkových väzieb;
·Znížiť koncentráciu primérov – znížiť možnosť väzby nadbytočných primérov a necieľových oblastí;
Nízka účinnosť zosilnenia
Opačná situácia k nešpecifickému zosilneniu – nízka účinnosť zosilnenia a opatrenia na riešenie nízkej účinnosti zosilnenia sú presne opačné:
·Predĺžte dobu žíhania a predĺženia;
· Zmeňte na trojkrokovú PCR a znížte teplotu žíhania;
·Zvýšte koncentráciu základného náteru;
Ps: Veľa postgraduálnych študentov narodených v 90-tych rokoch nie je ochotných študovať, ako ladiť experimenty, a dúfajú, že súprava dokáže problém úplne vyriešiť (ak chcete ísť do reagenčnej spoločnosti robiť výskum a vývoj po ukončení štúdia), v skutočnosti takto rozmýšľajú aj výrobcovia činidiel, dúfam, že je to blázon. .Aby sa problém ľahko vyriešil, hlupáci si stále musia prečítať úvod spoločnosti reagentov, aby zistili, či existuje faktor, ktorý absorbuje slabé vodíkové väzby.
Ťažký výber koncentrácie priméru a problémy s primérmi-dimérmi
Metóda 1: Všeobecne povedané, pokyny súpravy pre qPCR obsahujú odporúčané systémy a odporúčané koncentrácie primerov.
Metóda 2: Ladenie nastavením gradientu koncentrácie priméru.Obrázok nižšie je pre ilustráciu ukradnutý jednej spoločnosti.Obrázok nižšie ukazuje fluorescenčné kvantitatívne výsledky získané s tromi gradientmi koncentrácie priméru (100 nM, 250 nM, 500 nM) a štyrmi gradientmi koncentrácie templátu (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Hodnota Ct experimentálnych výsledkov je vynesená takto:

Výber koncentrácie priméru Zreťazte každú koncentráciu priméru do línie nasledovne:

Voľba koncentrácie priméru je zrejmá, lineárny vzťah koncentrácie priméru 100 nM a 250 nM je lepší a lineárny vzťah koncentrácie priméru 500 nM je relatívne slabý.V 100 nM a 250 nM je Ct hodnota 250 nM relatívne malá, takže optimálna koncentrácia priméru je 250 nM.Na krivke topenia možno vo všeobecnosti vidieť silné primér-diméry.Čo ak sa navrhnuté primery nedokážu vyhnúť primer-dimérom?
Metóda 3: Znížte množstvo primerov a zvýšte teplotu žíhania (netreba vysvetľovať).
Empirická hodnota teploty žíhania je 60°C.Ak si nie ste istí, ako zvoliť vhodnejšiu teplotu žíhania?Odpoveď je rovnaká ako výber koncentrácie primeru –gradientový test.Na ilustráciu problému urobte obrázok od spoločnosti Bio-rad.Na amplifikáciu určitého cieľového fragmentu nastavte osem teplotných gradientov, každý s tromi opakovaniami, a získaná amplifikačná krivka je nasledovná:

výber teploty žíhania:
·70°C, 69°C—Priméry sa v zásade nedajú kombinovať, takže nedochádza k amplifikácii.
·67,3°C – Na začiatku je malé zosilnenie a hodnota Ct je relatívne veľká.
·64,5°C——Hodnota Ct klesá.
· Pri 60,7 °C, 58,0 °C, 56,2 °C a 55,0 °C mali hodnoty Ct v zásade tendenciu byť stabilné, ale konečné hodnoty fluorescencie boli odlišné.
Ako si vybrať?Princíp: Prvým princípom je vyššia hodnota Ct.Pre rovnakú hodnotu Ct zvoľte vyššiu teplotu žíhania, aby ste sa vyhli dimerizácii a nešpecifickej amplifikácii.Hoci je pri 55 °C vyššia hodnota fluorescencie, môžu sa v nej vyskytovať diméry alebo nešpecifická amplifikácia.
Ale ak ste taký chytrý ako vy, určite si pomyslíte: Logicky povedané, ak je reakcia PCR veľmi špecifická, pokiaľ koncentrácia primeru presahuje minimálnu požiadavku, vysoké a nízke body by nemali mať žiadny vplyv, rovnako ako fluorescenčné farbivá a dNTP.V skutočnosti, pokiaľ je teplota žíhania správne optimalizovaná, účinok koncentrácie priméru na hodnotu Ct bude prirodzene minimalizovaný.

Teplota žíhania je správne optimalizovaná a vplyv koncentrácie primeru na CT bude minimalizovaný
Sekundárna štruktúra ovplyvňuje účinnosť zosilnenia
Zoberme si obrázok z Bio-rad na ilustráciu problému.Navrhuje tiež teplotný gradient na amplifikáciu génu so sekundárnou štruktúrou.

Objaví sa sekundárna štruktúra
Je možné vidieť, že keď sa teplotný gradient znižuje, začnú sa objavovať produkty a hodnota Ct sa posúva dopredu, pričom minimálna hodnota dosahuje pri 60,7 °C, a potom, keď sa teplotný gradient znižuje, hodnota Ct sa zvyšuje.Naopak, pri zvyšovaní teploty sa sekundárna štruktúra otvára a zvyšuje sa účinnosť zosilnenia.Po dosiahnutí určitej teploty zvýšenie teploty nemôže zlepšiť účinnosť zosilnenia.Pretože priméry sa v tejto chvíli nedajú stabilne kombinovať.pretohľadajte teplotu s najnižšou hodnotou Ct, čo je najlepšia teplota na zosilnenie šablóny sekundárnej štruktúry!Samozrejme, chytrí blázni musia vedieť, že ak to nie je potrebné, je najlepšie vymeniť priméry a vyhnúť sa oblasti sekundárnej štruktúry.
5. Úroveň aplikácie
MIQE — Analýza údajov

Analýzu dát vykonáva hlavne fluorescenčný kvantitatívny PCR prístroj.V predchádzajúcom článku sa vykonalo veľa práce na analýze údajov, ako je napríklad slepá kontrola, ktorá bola vysvetlená v návrhu experimentu.Boli objasnené interné referenčné gény, počty opakovaní atď., tu vysvetľujeme hlavne aplikáciu qPCR.
qPCR je široko používaný a experimentálne overenie a diagnostika nukleových kyselín sú najčastejšie používané scenáre.
absolútna kvantifikácia
Log (počiatočná koncentrácia) má lineárny vzťah s počtom cyklov.Štandardná krivka môže byť nakreslená zo štandardu so známym počiatočným počtom kópií, to znamená, že je možné získať lineárny vzťah amplifikačnej reakcie.Podľa hodnoty Ct vzorky je možné vypočítať koncentráciu vo vzorke.Množstvo šablón, ktoré sa majú zahrnúť.

Metóda absolútneho kvantitatívneho výpočtu
Absolútna kvantifikácia musí byť založená na štandardnej krivke.Na vytvorenie štandardnej krivky je potrebný štandard.Obvykle je štandardom plazmid získaný klonovaním cieľového génu.Prečo je to plazmid?Pretože kruhová plazmidová DNA je najstabilnejšia.Štandardný produkt zrieďte v 5 až 6 gradientoch podľa dvojnásobného pomeru (10-násobné riedenie) a pri riedení dbajte na rovnomernosť.Nechajte hodnotu Ct klesnúť medzi 15-30.

Štandardná príprava
Súčasne by sa mala testovaná vzorka tiež zodpovedajúcim spôsobom zriediť (pamätajte na faktor riedenia) a hodnota Ct by mala tiež klesnúť medzi 15-30.Štandardný produkt + vzorka, ktorá sa má testovať, sú umiestnené na stroji spoločne.Po vykonaní testu sa vytvorila štandardná krivka so štandardnou látkou a vzorky, ktoré sa mali testovať, sa preniesli do štandardnej krivky, aby sa vypočítala koncentrácia.
Kvantifikácia vírusu hepatitídy B HBV je typická absolútna kvantifikácia, ktorá dokáže vypočítať počet kópií vírusu v 1 ml krvi.
Výpočet počtu kópií
Koncentrácia vzorky na testovanie (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × faktor riedenia
Molekulová hmotnosť vzorky = počet báz × 324
Počet kópií vzorky, ktorá sa má testovať (kópie/ul) = koncentrácia vzorky, ktorá sa má testovať / molekulová hmotnosť vzorky × 6 × 1014

Spôsob výpočtu počtu kópií

Vyššie uvedené je metóda výpočtu na určenie množstva.Toto je matematický problém, ktorý sa dá vyriešiť po absolvovaní strednej školy, a matematické problémy vo všeobecnosti riešia počítače.Ak nerozumiete, môžete prísť komunikovať.
relatívna kvantifikácia
Relatívna kvantifikácia sa používa najmä vo vedeckom výskume.Koľko vírusov je v 1 ml krvi a ide o DNA vírus, je to pomerne deterministický dej: dá sa určiť množstvo krvi a DNA vírus je relatívne stabilný.Je však pre nás ťažké porovnať počet transkripčných kópií určitého génu v liste, pretože je ťažké určiť veľkosť, hmotnosť a citlivosť listu, je ťažké určiť množstvo extrahovanej RNA a tiež je ťažké určiť účinnosť reverznej transkripcie, to znamená, že akýkoľvek krok môže spôsobiť, že experimentálne údaje budú obsahovať chyby a nebudú sa dať použiť.
Preto musí relatívna kvantifikácia zaviesť prvok:vnútorný referenčný gén.
Inými slovami, relatívna kvantifikácia je vlastne porovnanie medzi cieľovým génom a interným referenčným génom.V porovnaní v rovnakom tkanive a tej istej bunke je vplyv veľkosti vzorky, množstva extrakcie RNA, účinnosti reverznej transkripcie a účinnosti PCR relatívne malý.Kvôli malej veľkosti vzorky boli interné referenčné gény aj cieľové gény relatívne znížené.To je dôvod, prečo sme už predtým kládli dôraz na jednotnosť a stabilitu.
Interné referenčné gény sú všeobecneupratovacie gény(house-keeping gény), ktoré označujú triedu génov, ktoré sú stabilne exprimované vo všetkých bunkách a ich produkty sú nevyhnutné na udržanie základných životných aktivít buniek.
Nepleťte si tento pojem.Domáce gény sú termíny biologických funkcií, zatiaľ čo interné referenčné gény sú experimentálne technické termíny.Gény pre upratovanie musia prejsť validáciou, než môžu byť vybrané ako interné referenčné gény.
Napríklad sme na obrázku nižšie vybrali niekoľko prevádzkových génov, aby sme otestovali ich úrovne expresie v rôznych tkanivových bunkách a zistili sme, že úrovne expresie β-2-mikroglobulínu boli celkom odlišné od hladín ostatných troch génov, takže ich nebolo možné použiť ako interné referenčné gény.

Po pochopení korekčnej funkcie interného referenčného génu sa odvodia dva algoritmy vďaka zavedeniu interného referenčného génu.
· metóda dvojitej štandardnej krivky
·2 – △△Ct metóda (metóda porovnávania hodnôt CT)
Ak máte záujem študovať funkcie druhov a génov, vzdajte sa výskumu algoritmov a použite priamo vzorce alebo použite priamo stroje;ak ste priamy chlap v matematike a inžinierstve, pokojne.
metóda dvojitej štandardnej krivky
Kvantifikujte cieľový gén a prevádzkový gén kontrolnej vzorky a vzorky, ktorá sa má testovať, prostredníctvom štandardnej krivky a potom vypočítajte relatívnu hodnotu podľa vzorca na výpočet, čo je relatívna hladina expresie.
Výhody: jednoduchá analýza, relatívne jednoduchá experimentálna optimalizácia
Nevýhoda: Pre každý gén musí každé kolo experimentov vytvoriť štandardnú krivku
Aplikácia: Jedna z dvoch najčastejšie používaných a uznávaných relatívnych kvantitatívnych metód pri štúdiu regulácie génovej expresie
Vzorec je nasledovný:

Príklady sú nasledovné:

Vypočítajte relatívne množstvo na základe kvantitatívneho výsledku
2 – metóda △△Ct (metóda porovnávania hodnôt CT)

Výhody: Nie je potrebné robiť štandardnú krivku
Nevýhody: Predpokladá sa, že účinnosť zosilnenia je blízka 100 %;štandardná odchýlka je < 5 % a predpokladá sa, že štandardná krivka a účinnosť medzi každou amplifikáciou sú konzistentné;optimalizácia experimentálnych podmienok je zložitejšia.
Aplikácia: Jedna z dvoch najčastejšie používaných a uznávaných relatívnych kvantitatívnych metód pri štúdiu regulácie génovej expresie

Samozrejme, účinnosť amplifikácie zvyčajne nie je možné dosiahnuť dokonale 1. Metóda korekcie: Ak vieme, že cieľový gén a referenčný gén majú rovnakú účinnosť amplifikácie, ale účinnosť amplifikácie sa nerovná 1, potom 2－△△Ct možno opraviť ako: (1+E )－ je△△5 účinnosť ampl. 1,95－△△Ct
Zatiaľ sa obsah o fluorescenčnej kvantitatívnej PCR skončil.