Foreasy Taq DNA polymeráza
Popis
Foreasy Taq DNA polymeráza je nový enzým Taq exprimovaný v baktériách Escherichia coli inžinierstva pomocou technológie génovej rekombinácie.Samotný enzým má určitú aktivitu horúceho štartu a môže byť použitý pre konvenčnú PCR a qPCR;má aktivitu 5'→3' DNA polymerázy a 5'→3' exonukleázovú aktivitu, ale nemá aktivitu 3'→5' exonukleázy.
Komponenty súpravy
Komponent | IM-01011 | IM-01012 | IM-01013 |
Foreasy Taq DNA polymeráza(5 U/μL) | 5 000 U (1 ml) | 50 KU (10 ml) | 500 KU (100 ml) |
2x Taq reakčný pufer | 25 ml × 5 | 250 ml × 5 | 500 ml × 25 |
Vlastnosti a výhody
- Vysoká špecifickosť: Enzým má určitú aktivitu horúceho štartu.
- Rýchle zosilnenie: 10 s/kb.
- Vysoko adaptabilný templát: možno ho použiť na efektívnu amplifikáciu GC templátu DNA s vysokou hodnotou a rôznymi ťažko amplifikovateľnými.
- Silná vernosť: obyčajný enzým Taq 6-krát.
- Silná tepelná stabilita: Môže byť umiestnený pri teplote 37 ° C na týždeň a zachováva si viac ako 90% aktivitu
Aplikácia súpravy
Rôzne systémy PCR/qPCR a systémy priamej PCR
PCR amplifikácia fragmentov DNA
Značenie DNA
Sekvenovanie DNA
PCR A-tailed
U Definícia
1U: Množstvo enzýmu potrebné na začlenenie 10 nmol deoxynukleotidov do hmoty nerozpustnej v kyseline s použitím aktivovanej DNA spermie lososa ako templátu/priméru počas 30 minút pri 74 °C.
Reakčný stav
Teplota | Čas | Cyklus |
37 °C | 5 min | 1 |
94 °C | 5 min | 1 |
94 °C | 10 sekúnd | 35 |
60 °C | 10 sekúnd | |
72 °C | 20 sekúnd/kb | |
72 °C | 2 min | 1 |
Skladovanie
-20 ± 5 °C na 2 roky alebo pri -80 °C na dlhodobé skladovanie.
Žiadne zosilňovacie signály
1. Taq DNA polymeráza v súprave stráca svoju aktivitu v dôsledku nesprávneho skladovania alebo exspirácie súpravy.
Odporúčanie: Potvrďte podmienky skladovania súpravy;znovu pridajte vhodné množstvo Taq DNA polymerázy do systému PCR alebo si zakúpte novú súpravu Real Time PCR Kit pre súvisiace experimenty.
2. V templáte DNA je veľa inhibítorov Taq DNA polymerázy.
Návrh: Prečistite šablónu alebo znížte množstvo použitej šablóny.
3. Koncentrácia Mg2+ nie je vhodná.
Odporúčanie: Koncentrácia Mg2+ v nami poskytovanom 2× Real PCR Mix je 3,5 mM.Avšak pre niektoré špeciálne priméry a templáty môže byť koncentrácia Mg2+ vyššia.Preto môžete priamo pridať MgCl2 na optimalizáciu koncentrácie Mg2+.Kvôli optimalizácii sa odporúča zakaždým zvýšiť Mg2+ o 0,5 mM.
4. Podmienky amplifikácie PCR nie sú vhodné a sekvencia primérov alebo koncentrácia sú nevhodné.
Návrh: potvrďte správnosť sekvencie priméru a primér nebol degradovaný;ak amplifikačný signál nie je dobrý, skúste znížiť teplotu žíhania a primerane upravte koncentráciu priméru.
5. Množstvo šablóny je príliš malé alebo príliš veľké.
Odporúčanie: Vykonajte riedenie gradientom linearizácie templátu a vyberte koncentráciu templátu s najlepším efektom PCR pre experiment PCR v reálnom čase.
NTC má príliš vysokú hodnotu fluorescencie
1.Kontaminácia činidlom spôsobená počas prevádzky.
Odporúčanie: Vymeňte za nové reagencie pre experimenty PCR v reálnom čase.
2. Ku kontaminácii došlo počas prípravy reakčného systému PCR.
Odporúčanie: Počas prevádzky urobte potrebné ochranné opatrenia, ako napríklad: noste latexové rukavice, používajte špičku pipety s filtrom atď.
3. Priméry sú degradované a degradácia primérov spôsobí nešpecifickú amplifikáciu.
Návrh: Pomocou elektroforézy SDS-PAGE zistite, či sú priméry degradované, a nahraďte ich novými primérmi pre experimenty PCR v reálnom čase.
Primérový dimér alebo nešpecifická amplifikácia
1. Koncentrácia Mg2+ nie je vhodná.
Odporúčanie: Koncentrácia Mg2+ v nami poskytovanom 2× Real PCR EasyTM Mix je 3,5 mM.Avšak pre niektoré špeciálne priméry a templáty môže byť koncentrácia Mg2+ vyššia.Preto môžete priamo pridať MgCl2 na optimalizáciu koncentrácie Mg2+.Kvôli optimalizácii sa odporúča zakaždým zvýšiť Mg2+ o 0,5 mM.
2. Teplota žíhania PCR je príliš nízka.
Návrh: Zvýšte teplotu žíhania PCR zakaždým o 1 °C alebo 2 °C.
3. Produkt PCR je príliš dlhý.
Odporúčanie: Dĺžka produktu PCR v reálnom čase by mala byť medzi 100-150 bp, nie viac ako 500 bp.
4. Priméry sú degradované a degradácia primérov povedie k objaveniu sa špecifickej amplifikácie.
Návrh: Pomocou elektroforézy SDS-PAGE zistite, či sú priméry degradované, a nahraďte ich novými primérmi pre experimenty PCR v reálnom čase.
5. Systém PCR je nesprávny alebo je príliš malý.
Návrh: Systém reakcie PCR je príliš malý, čo spôsobí zníženie presnosti detekcie.Na opätovné spustenie experimentu PCR v reálnom čase je najlepšie použiť reakčný systém odporúčaný nástrojom na kvantitatívnu PCR.
Zlá opakovateľnosť kvantitatívnych hodnôt
1. Prístroj nefunguje správne.
Návrh: Medzi každým otvorom PCR v prístroji môžu byť chyby, čo má za následok zlú reprodukovateľnosť počas riadenia teploty alebo detekcie.Skontrolujte prosím podľa pokynov príslušného prístroja.
2. Čistota vzorky nie je dobrá.
Odporúčanie: Nečisté vzorky budú viesť k zlej reprodukovateľnosti experimentu, čo zahŕňa čistotu templátu a primerov.Najlepšie je prečistiť templát a priméry sa najlepšie purifikujú pomocou SDS-PAGE.
3. Čas prípravy a skladovania systému PCR je príliš dlhý.
Návrh: Systém Real Time PCR použite na experiment PCR ihneď po príprave a nenechávajte ho bokom príliš dlho.
4. Podmienky amplifikácie PCR nie sú vhodné a sekvencia primérov alebo koncentrácia sú nevhodné.
Návrh: potvrďte správnosť sekvencie priméru a primér nebol degradovaný;ak amplifikačný signál nie je dobrý, skúste znížiť teplotu žíhania a primerane upravte koncentráciu priméru.
5. Systém PCR je nesprávny alebo je príliš malý.
Návrh: Systém reakcie PCR je príliš malý, čo spôsobí zníženie presnosti detekcie.Na opätovné spustenie experimentu PCR v reálnom čase je najlepšie použiť reakčný systém odporúčaný nástrojom na kvantitatívnu PCR.