Nízky pomer A260/A230 je zvyčajne spôsobený nečistotami s maximálnou absorpčnou vlnovou dĺžkou 230 nm.Pozrime sa, čo tieto nečistoty zahŕňajú:

• Bežné znečisťujúce látky	Absorpčná vlnová dĺžka	Pomerový efekt
  Proteín	~230 nm a 280 nm	Súčasné zníženie A260/A 280a A260/A 280pomerov
  Guanidínová soľ	220-240 nm	Znížte A260/A 280pomer
  Fenol	~270 nm	-
  Trizol	~230 nm a 270 nm	Znížte A260/A 280pomer
  EDTA	~230 nm	Znížte A260/A 280pomer
  Etanol	230-240 nm	Znížte A260/A 280pomer

 
 
 
Vlnová dĺžka absorpcie a hodnota kontrastu bežných znečisťujúcich látok

Pkontaminácia bielkovinami
Znečistenie proteínmi možno považovať za najbežnejšie znečistenie v procese extrakcie nukleových kyselín.Proteín existuje medzi hornou vodnou fázou a spodnouorganickéfáza .Znečistenie zníži pomer A260/A280 a A260/A230 súčasne a pomer A260/A230 sa zmení zreteľnejšie ako pomer A260/A280.
Počas následnéhoreverzná transkripciaor qPCR reakcie, proteínové zvyšky môžu inhibovať alebo interferovať s funkciou enzýmu.Najlepším spôsobom, ako sa vyhnúť kontaminácii proteínmi, je mať pri nasávaní supernatantu na pamäti zásadu „radšej menej ako viac, veľakrát malé množstvo“.

2. Znečistenie guanidíniom
hydrochlorid (GuHCl) a guanidíntiokyanát (GTC) majú za následok denaturáciu proteínov, ktoré môžu rýchlo zničiť bunkové membrány počas procesu extrakcie nukleových kyselín, čo spôsobí denaturáciu a zrážanie proteínov.Absorpčná vlnová dĺžka GuHCl a GTC je medzi 220-240 nm, azvyšková guanidíniová soľ zníži pomer A260/A230.Hoci zvyšková guanidíniová soľ zníži pomer,vplyv na následné experimenty je v skutočnosti zanedbateľný.

3. Kontaminácia trizolom
Hlavnou zložkou Trizolu je fenol.Hlavnou funkciou fenolu je lýzovať bunky a uvoľňovať proteíny a látky nukleových kyselín v bunkách.Hoci fenol môže účinne denaturovať proteíny, nemôže úplne inhibovať aktivitu RNázy.Preto sa k TRIzolu pridávajú 8-hydroxychinolín, guanidín izotiokyanát, β-merkaptoetanol atď. na inhibíciu endogénnej a exogénnej RNázy.
Pri extrakcii bunkovej RNA môže Trizol rýchlo lyzovať bunky a inhibovať nukleázu uvoľnenú z buniek a zvyškový Trizol výrazne zníži pomer A260/A230.
Spôsob spracovania: Pri odstreďovaní je potrebné poznamenať, že fenol v Trizole je ľahko rozpustný vo vodnej fáze za podmienok 4° a izbovej teploty.

4. Etanolový zvyšok
Etanol sa používa v konečnom procese na vyzrážanie DNA, pričom sa rozpúšťajú ióny solí, ktoré môžu byť naviazané na DNA.Vlnová dĺžka absorpcie je najvyššiaabsorpčný vrcholetanol je tiež pri 230-240 nm, čozníži aj pomer A260/A230.
Metódu zamedzenia zvyšku etanolu možno zopakovať dvakrát počas záverečnej elúcie, fúkanímdigestorpo dobu dvoch minút, aby sa umožnilo úplné odparenie etanolu pred pridaním pufra na elúciu.
Malo by však byť známe, že pomer je len hodnotiacim indexom kvality RNA.Ak sú vyššie uvedené operácie prísne regulované, odchýlka medzi pomerom a štandardným rozsahom nebude mať veľký vplyv na následné experimenty.
Súvisiace produkty:
Súprava na izoláciu zvieracej celkovej RNA
Súprava na izoláciu rastlinnej celkovej RNA
Súprava na izoláciu bunkovej celkovej RNA
Plant Total RNA Isolation kit Plus