Sterilizácia špičiek pipiet a EP skúmaviek atď.

1. Pripravte 0,1% (jedna tisícina) DEPC (vysoko toxická látka) s deionizovanou vodou, opatrne ju použite v digestore a skladujte ju pri 4°C mimo dosahu svetla;

DEPC voda je čistá voda upravená DEPC a sterilizovaná vysokou teplotou a vysokým tlakom.Testované, že neobsahuje RNázu, DNázu a proteinázu.

2. Vložte špičku pipety a EP skúmavku do 0,1 % DEPC a uistite sa, že špička pipety a EP skúmavka sú naplnené 0,1 % DEP.

3. Chráňte pred svetlom, nechajte odstáť cez noc (12-24h)

4. Krabičku obsahujúcu hrot a EP skúmavku nie je potrebné namáčať v DEPC.Po hrubom odstránení DEPC vody zo špičky alebo EP skúmavky ju zabaľte a zabaľte.

5. 121 stupňov Celzia, 30min

6. 180 stupňov Celzia, sušiť niekoľko hodín (aspoň 3 hodiny)

Poznámka: a.Pri manipulácii s DEPC noste latexové rukavice a masky!b, alebo bez sterilizácie DEPC, 130 ℃, 90 minút autoklávu (v mnohých laboratóriách sterilizácia pri vysokej teplote dvakrát)

Úvahy o extrakcii RNA

Dva hlavné javy zlyhania izolácie tkanivovej RNA

degradácia RNA a zvyšky nečistôt v tkanivách,čo sa týka degradácie, pozrime sa najprv na to, prečo RNA extrahovaná z kultivovaných buniek nie je ľahko degradovateľná.Všetky existujúce činidlá na extrakciu RNA obsahujú zložky, ktoré rýchlo inhibujú RNázu.Pridajte lyzát do kultivovaných buniek a jednoducho to premiešajte, všetky bunky sa môžu dôkladne premiešať s lyzátom a bunky sú úplne lyzované.Po lýze buniek aktívne zložky v lyzáte okamžite inhibujú intracelulárnu RNázu, takže RNA zostáva nedotknutá.To znamená, že pretože kultivované bunky sú ľahko a úplne v kontakte s lyzátom, ich RNA nie je ľahko degradovateľná;na druhej strane RNA v tkanive sa ľahko degraduje, pretože bunky v tkanive nie sú ľahké rýchlo kontaktovať lyzát.z dôvodu dostatočného kontaktu.takže,za predpokladu, že existuje spôsob, ako premeniť tkanivo na jedinú bunku a zároveň inhibovať aktivitu RNA, problém degradácie by mohol byť úplne vyriešený.

Najúčinnejšou takouto metódou je mletie v kvapalnom dusíku.Metóda mletia v kvapalnom dusíku je však veľmi problematická, najmä ak je počet vzoriek veľký.Z toho vznikla ďalšia najlepšia vec: homogenizátor.Thehomogenizátormetóda neberie do úvahy otázku, ako je aktivita RNázy inhibovaná predtým, ako sa bunky dostanú do kontaktu s lyzátom, ale skôr sa modlí, aby rýchlosť rozrušovania tkaniva bola rýchlejšia ako rýchlosť, ktorou intracelulárna RNáza degraduje RN.

Účinok elektrického homogenizátora je lepší,a účinok skleneného homogenizátora je slabý, ale vo všeobecnosti metóda homogenizátora nemôže zabrániť javu degradácie.Preto ak dôjde k znehodnoteniu extrakcie, mal by sa na mletie tekutým dusíkom použiť pôvodný elektrický homogenizátor;pôvodný sklenený homogenizátor by sa mal vymeniť za elektrický homogenizátor alebo priamo rozomlieť tekutým dusíkom.Problém je takmer 100% realizovateľný.vyriešiť.

Problém zvyškov nečistôt ovplyvňujúci následné experimenty má rôzne príčiny ako degradácia a riešenia sú zodpovedajúcim spôsobom odlišné.Na záver,ak je v tkanive degradácia alebo zvyškové nečistoty, musí sa optimalizovať extrakčná metóda/reagent pre špecifický experimentálny materiál.Nemusíte použiť svoje vzácne vzorky na optimalizáciu: môžete si kúpiť nejaké malé zvieratá, ako sú ryby/kurčatá, z trhu, zobrať zodpovedajúcu časť materiálu na extrakciu RNA a druhú časť na extrakciu bielkovín – rozdrviť extraktom z úst, žalúdka a čriev.

Cieľová RNA extrahovanej RNA sa používa na rôzne následné experimenty a jej požiadavky na kvalitu sú rôzne

Konštrukcia knižnice cDNA vyžaduje integritu RNA bez zvyškov inhibítorov enzýmovej reakcie;Northern vyžaduje vyššiu integritu RNA a nižšie požiadavky na zvyšky inhibítorov enzýmovej reakcie;RT-PCR nevyžaduje príliš vysokú integritu RNA,ale inhibuje enzýmové reakcie.Požiadavky na rezíduá sú prísne.Vstup určuje výstup;zakaždým, keď je cieľom získať RNA najvyššej čistoty, bude to stáť ľudí a peniaze.

Odber/uskladnenie vzoriek

Faktory ovplyvňujúce degradáciu Keď vzorka opustí živé telo/alebo pôvodné rastové prostredie, endogénne enzýmy vo vzorke začnú degradovať RNA,a rýchlosť degradácie súvisí s obsahom endogénnych enzýmov a teplotou.Tradične existujú len dva spôsoby, ako úplne inhibovať aktivitu endogénneho enzýmu: okamžite pridať lyzát a dôkladne a rýchlo ho homogenizovať;nakrájajte na malé kúsky a ihneď zmrazte v tekutom dusíku.Oba prístupy vyžadujú rýchlu prevádzku.Druhý je vhodný pre všetky vzorky, zatiaľ čo prvý je vhodný len pre tkanivá s nízkym obsahom buniek a endogénnych enzýmov a ľahšie sa homogenizujú.Konkrétne rastlinné tkanivo, pečeň, týmus, pankreas, slezina, mozog, tuk, svalové tkanivo atď. je najlepšie zmraziť tekutým dusíkom predtým, ako budete pokračovať.

Fragmentácia a homogenizácia vzoriek

Faktory ovplyvňujúce degradáciu a výťažnosť Fragmentácia vzorky jena dôkladnú homogenizáciu, čo je pre úplné a úplné uvoľnenie RNA.Bunky môžu byť priamo homogenizované bez toho, aby sa rozbili.Tkanivá môžu byť homogenizované až po rozbití.Kvasinky a baktérie musia byť pred homogenizáciou rozbité zodpovedajúcimi enzýmami.Tkanivá s nižším obsahom endogénnych enzýmov a ľahšou homogenizáciou môžu byť rozdrvené a homogenizované naraz v lyzáte pomocou homogenizátora;rastlinné tkanivo, pečeň, týmus, pankreas, slezina, mozog, tuk, svalové tkanivo a iné vzorky, majú vysoký obsah endogénnych enzýmov alebo sa nedajú ľahko homogenizovať,takže rozrušenie tkaniva a homogenizácia sa musia vykonávať oddelene.Najspoľahlivejšou a najproduktívnejšou metódou fragmentácie je mletie tekutým dusíkom a najspoľahlivejšou metódou homogenizácie je použitie elektrického homogenizátora.Špeciálna poznámka k mletiu s tekutým dusíkom: vzorka sa nesmie rozmraziť počas celého procesu mletia, pretože endogénne enzýmy budú pravdepodobnejšie fungovať pri zmrazení.

Výber lyzátu

Ovplyvnenie pohodlnosti prevádzky a faktorov zvyškových endogénnych nečistôt Bežne používané lyzačné roztoky môžu takmer inhibovať aktivitu RNázy.Preto je kľúčovým bodom výberu lyzačného roztoku zvážiť kombináciu s purifikačnou metódou.Existuje jedna výnimka:pri vzorkách s vysokým obsahom endogénnych enzýmov sa odporúča použiť lyzát s obsahom fenolu na zvýšenie schopnosti inaktivovať endogénne enzýmy.

Výber spôsobu čistenia

Faktory, ktoré ovplyvňujú zvyškové endogénne nečistoty, rýchlosť extrakcie Pre čisté vzorky, ako sú bunky, je možné dosiahnuť uspokojivé výsledky takmer akoukoľvek dostupnou metódou čistenia.Ale pre mnohé iné vzorky, najmä tie s vysokými hladinami nečistôt, ako sú rastliny, pečeň, baktérie atď., je výber vhodnej purifikačnej metódy kľúčový.Metóda odstredivého čistenia na kolóne má vysokú rýchlosť extrakcie a dokáže účinne odstrániť nečistoty, ktoré ovplyvňujú následnú enzymatickú reakciu RNA, ale je drahá (Foregene môže ponúknuť cenovo výhodné súpravy, viac podrobností kliknitetu);použitie ekonomických a klasických čistiacich metód, ako je zrážanie LiCl, môže tiež získať uspokojivé výsledky, ale prevádzkový čas je dlhý..

„Tri disciplíny a osem pozornosti“ pre extrakciu RNA

1. disciplína:Ukončite kontamináciu exogénnymi enzýmami.

Poznámka 1:Striktne noste masky a rukavice.

Poznámka 2:Odstredivkové skúmavky, hlavy špičiek, pipetové tyčinky, elektroforézne nádoby a experimentálne lavice zapojené do experimentu by sa mali dôkladne zlikvidovať.

Poznámka 3:Činidlá/roztoky zahrnuté v experimente, najmä voda, musia byť bez RNázy.

2. disciplína:Blokujte aktivitu endogénnych enzýmov

Poznámka 4:Vyberte vhodnú metódu homogenizácie.

Poznámka 5:Vyberte vhodný lyzát.

Poznámka 6:Kontrolujte počiatočné množstvo vzorky.

3. disciplína:Ujasnite si účel extrakcie

Poznámka 7:Keď sa akýkoľvek lyzátový systém blíži k maximálnemu počiatočnému množstvu vzorky, miera úspešnosti extrakcie prudko klesá.

Poznámka 8:Jediným ekonomickým kritériom pre úspešnú extrakciu RNA je úspech v nasledujúcich experimentoch, nie výťažok.

10 najlepších zdrojov kontaminácie RNázou

1. Prsty sú prvým zdrojom exogénnych enzýmov, preto sa rukavice musia často nosiť a vymieňať.Okrem toho treba nosiť aj masky, pretože dýchanie je tiež dôležitým zdrojom enzýmov.Ďalšou výhodou nosenia masky v rukaviciach je ochrana experimentátora.

2. Špičky pipiet, odstredivkové skúmavky, pipety – RNázu nie je možné inaktivovať samotnou sterilizáciou, takže špičky pipiet a odstredivkové skúmavky by mali byť ošetrené DEPC, aj keď sú označené ako ošetrené DEPC.Najlepšie je použiť pipetu na špeciálne účely, pred použitím ju utrite vatou s obsahom 75% alkoholu, najmä tyčinku;okrem toho urcite nepouzivaj odstraňovač hlavy.

3. Voda/tlmivý roztok nesmie obsahovať kontamináciu RNázou.

4. Testovací stôl by sa mal utrieť aspoň 75% alkoholovými vatovými tampónmi.

5. Endogénna RNáza Všetky tkanivá obsahujú endogénne enzýmy, takže rýchle zmrazenie tkanív tekutým dusíkom je najlepší spôsob, ako znížiť degradáciu.Spôsob skladovania/mletia tekutého dusíka je skutočne nepohodlný, ale je to jediný spôsob pre tkanivá s vysokými hladinami endogénnych enzýmov.

6. Vzorky RNA Produkty extrakcie RNA môžu obsahovať stopy kontaminácie RNázou.

7. Extrakcia plazmidu Extrakcia plazmidu často využíva RNázu na degradáciu RNA a zvyšková RNáza by sa mala štiepiť proteinázou K a extrahovať pomocou PCI.

8. Skladovanie RNA Aj keď sa skladuje pri nízkej teplote, stopové množstvá RNázy spôsobia degradáciu RNA.Najlepším riešením na dlhodobé uchovanie RNA je suspenzia soľ/alkohol, pretože alkohol pri nízkych teplotách inhibuje všetku enzymatickú aktivitu.

9. Keď katióny (Ca, Mg) obsahujú tieto ióny, zahrievanie na 80 C počas 5 minút spôsobí štiepenie RNA, takže ak je potrebné RNA zahriať, konzervačný roztok musí obsahovať chelatačné činidlo (1 mM citrát sodný, pH 6,4).

10. Enzýmy použité v nasledujúcich experimentoch môžu byť kontaminované RNázou.

10 tipov na extrakciu RNA

1: Rýchlo zabráňte aktivite RNázy.Vzorky sú po odbere rýchlo zmrazené a RNáza je inaktivovaná rýchlou operáciou počas lýzy.

2: Vyberte vhodnú extrakčnú metódu pre tkanivo s vysokým obsahom ribozýmu a tukové tkanivo je najlepšie použiť metódu obsahujúcu fenol.

3: Kvalita predikcie vyžaduje Northern, konštrukcia knižnice cDNA vyžaduje vysokú integritu a RT-PCR a RPA (test ochrany ribonukleázy) nevyžadujú vysokú integritu.RT-PCR vyžaduje vysokú čistotu (zvyšky enzýmového inhibítora).

4: Dôkladná homogenizácia je kľúčom k zlepšeniu výťažku a zníženiu degradácie.

5: Skontrolujte integritu detekcie RNA elektroforézou, 28S:18S = 2:1 je úplný znak, 1:1 je tiež prijateľný pre väčšinu experimentov.

6: Odstránenie DNA pre RT-PCR, analýza čipu Na odstránenie DNA je najlepšie použiť Dnázu I.

7: Znížte kontamináciu exogénnych enzýmov – enzýmy nie je možné importovať zvonku.

8: Pri koncentrácii nukleovej kyseliny s nízkou koncentráciou by sa malo pridať ko-precipitačné činidlo.Ale aby sa zabránilo ko-precipitantu obsahujúcemu enzýmy a kontaminácii DNA.

9: Dôkladne rozpustite RNA, ak je to potrebné, zahrejte na 65 C počas 5 minút.

vhodný spôsob skladovania

Krátkodobo ho možno skladovať pri –20 °C a dlhodobo pri –80 °C.Prvým krokom pri zlepšovaní výťažkov RNA je uvedomiť si, že obsah RNA v rôznych vzorkách sa veľmi líši.Vysoká hojnosť (2-4 ug/mg), ako je pečeň, pankreas, srdce, stredná hojnosť (0,05-2 ug/mg), ako je mozog, embryo, obličky, pľúca, týmus, vaječník, nízka hojnosť (<0,05 ug/mg) mg), ako je močový mechúr, kosť, tuk.

1: Lyžujte bunky na uvoľnenie RN – ak sa neuvoľní RNA, výťažok sa zníži.Elektrická homogenizácia funguje lepšie ako iné metódy homogenizácie, ale môže byť potrebné ju kombinovať aj s inými metódami, ako je rmutovanie tekutým dusíkom, enzymatické štiepenie (lyzozým/lytikáza)

2: Optimalizácia metódy extrakcie.Najväčšie problémy s metódami na báze fenolu sú neúplná stratifikácia a čiastočná strata RNA (supernatant sa nedá úplne odstrániť).Neúplná stratifikácia je spôsobená vysokým obsahom nukleových kyselín a proteínov, čo je možné vyriešiť zvýšením množstva použitého lyzátu alebo znížením množstva vzorky.Do tukového tkaniva sa pridal krok extrakcie chloroformom.Stratu RNA je možné znížiť spätným čerpaním alebo odstránením organickej vrstvy a následnou centrifugáciou.Najväčším problémom metód založených na stĺpcovej centrifugácii je prebytok vzorky.

Klasické tipy na extrakciu

1. Čistenie fenolu: Pridajte rovnaký objem 1:1 fenol/chloroform a intenzívne miešajte 1-2 minúty.Centrifugujte pri vysokej rýchlosti 2 minúty.Opatrne odstráňte supernatant (80 – 90 %).Nikdy sa nedostaňte do strednej vrstvy.Rovnaký objem reakčného roztoku možno pridať do fenolu/chloroformu a odstrániť supernatant.Dva supernatanty sa môžu spolu zmiešať na zrážanie nukleových kyselín na zlepšenie výťažku.Pri miešaní nebuďte príliš jemní a nesnažte sa odstrániť všetok supernatant.

2. Premývanie 70-80% etanolom: Počas premývania musí byť nukleová kyselina suspendovaná, aby sa zabezpečilo vymytie zvyškov soli.Zároveň ihneď po vyliatí etanolu odstreďujte pri vysokej rýchlosti niekoľko sekúnd a potom odstráňte zvyšný etanol pomocou pipety.Po odstátí pri izbovej teplote počas 5-10 minút rozpustite.

11. Extrakcia špeciálnych organizácií

1. Vláknité tkanivo: Kľúčom k extrakcii RNA z vláknitého tkaniva, ako je srdcový/kostrový sval, je úplné rozrušenie tkaniva.Tieto tkanivá majú nízku hustotu buniek, takže množstvo RNA na jednotku hmotnosti tkaniva je nízke a najlepšie je použiť čo najviac východiskového množstva.Dbajte na to, aby ste tkanivo dôkladne rozdrvili v podmienkach mrazu.

2. Tkanivá s vysokým obsahom bielkovín/tukov: obsah mozgových/rastlinných tukov je vysoký.Po extrakcii PCI supernatant obsahuje biele vločky.Supernatant sa musí znovu extrahovať chloroformom.

3. Tkanivá s vysokým obsahom nukleových kyselín/ribozýmov: slezina/týmus má vysoký obsah nukleových kyselín a ribozýmov.Mletie tkaniva za mraziacich podmienok s následnou rýchlou homogenizáciou môže účinne inaktivovať ribozýmy.Ak je však lyzát príliš viskózny (kvôli vysokému obsahu nukleových kyselín), extrakcia PCI nebude schopná efektívne stratifikovať;tento problém môže vyriešiť pridanie ďalšieho lyzátu.Viacnásobné extrakcie PCI môžu odstrániť viac zvyškov DNA.Ak sa ihneď po pridaní alkoholu vytvorí biela zrazenina, znamená to kontamináciu DNA.Opätovná extrakcia kyslým PCI po rozpustení môže odstrániť kontamináciu DNA.

4. Rastlinné tkanivo: Rastlinné tkanivo je zložitejšie ako živočíšne.Vo všeobecnosti sa rastliny melú v podmienkach kvapalného dusíka, takže degradácia RNA endogénnymi enzýmami je nezvyčajná.Ak sa problém s degradáciou nevyrieši, je takmer určite spôsobený nečistotami obsiahnutými vo vzorke.Nečistoty obsiahnuté v mnohých rastlinách povedú k rezíduám a dôvodom rezíduí je často to, že tieto nečistoty majú určité podobnosti s RNA: vy sa vyzrážate a ja sa vyzrážam a vy sa adsorbujete a ja adsorbujem.Tieto vlastnosti určujú, že ide o veľmi silné inhibítory enzýmov.

V súčasnosti môžu byť komerčné činidlá na extrakciu RNA prispôsobené takmer všetkým živočíšnym tkanivám s malými úpravami, ale existuje len málo komerčných činidiel na extrakciu RNA, ktoré môžu byť vhodné pre väčšinu rastlinných tkanív.Našťastie Foregene môže poskytnúť špeciálnesúpravy na extrakciu rastlinnej RNA, mámeSúprava na izoláciu rastlinnej celkovej RNA, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Ten je špeciálne navrhnutý pre rastliny s vysokým obsahom polysacharidov a polyfenolov.Pri extrakcii RNA je spätná väzba od používateľov v laboratóriu obzvlášť dobrá.

12. Účinok zmrazovania a rozmrazovania vzorky Zmrazená vzorka môže byť väčšia a pred použitím na extrakciu RNA ju treba odrezať.Vzorky majú tendenciu topiť (možno čiastočne) počas rezania.Zmrazené vzorky možno bude potrebné pred extrakciou RNA odvážiť a počas tohto procesu určite dôjde k rozmrazeniu.Niekedy dochádza k rozmrazovaniu vzorky aj počas procesu mletia v kvapalnom dusíku;alebo sa zmrazená vzorka priamo pridá k lyzátu bez mletia v kvapalnom dusíku a rozmrazenie určite nastane pred úplnou homogenizáciou.Experimenty ukázali, že zmrazené tkanivo je náchylnejšie na degradáciu RNA počas rozmrazovania ako čerstvé tkanivo.Pravdepodobný dôvod: Proces zmrazovania a rozmrazovania narušuje štruktúry v bunke, čo uľahčuje priamy kontakt endogénnych enzýmov s RNA.

13. Posudzovanie kvality RNA Na posúdenie integrity RNA sa zvyčajne používa elektroforéza a na posúdenie čistoty RNA sa používa A260/A280.Teoreticky má intaktná RNA pomer 28S:18S = 2,7:1 a väčšina údajov zdôrazňuje pomer 28S:18S = 2:1.Faktom je, že takmer žiadna z RNA extrahovaných z iných vzoriek ako buniek nie je v pomere 2:1 (toto bolo získané pomocou Agilent Bioanalyzer).

Výsledky elektroforézy RNA sú ovplyvnené mnohými faktormi, vrátane sekundárnej štruktúry, podmienok elektroforézy, zaťaženia vzorky, stupňa saturácie EB atď. Na detekciu RNA použite natívnu elektroforézu a ako kontrolu použite DNA Marker.Ak sú 28S pri 2 kb a 18S pri 0,9 kb jasné a 28S: 18S > 1, integrita môže spĺňať požiadavky väčšiny nasledujúcich experimentov.

A260/A280 je indikátor, ktorý spôsobil veľa zmätku.V prvom rade je potrebné objasniť pôvodný význam tohto indikátora pre nukleové kyseliny: čistá RNA, jej A260/280 = asi 2,0.Čistá RNA je „príčina“ a A260/A280 = 2 je „účinok“.Teraz každý používa A260/A280 ako „príčinu“, mysliac si, že „ak A260/A280 = 2, potom je RNA čistá“, čo prirodzene vedie k zmätku.

Ak máte záujem, môžete do vzorky RNA pridať trochu činidla, ktoré sa často používa pri extrakcii, ako je fenol, guanidín izotiokyanát, PEG atď., a potom zmerať pomer A260/A280.Realita je taká, že mnohé z činidiel používaných na extrakciu RNA, ako aj mnohé nečistoty vo vzorke absorbujú okolo A260 a A280, čo ovplyvňuje A260/A280.

Najinštruktívnejší prístup v súčasnosti je skenovanie vzoriek RNA v rozsahu 200-300 nm.Krivka čistej RNA má nasledujúce charakteristiky: krivka je hladká, A230 a A260 sú dva inflexné body, A300 je blízko 0, A260/A280 = okolo 2,0 a A260/A230 = okolo 2,0.Ak údaje zo skenovania nie sú dostupné, musí sa určiť aj pomer A260/A230, pretože tento pomer je citlivejší na prenos všetkých nečistôt, ktoré ovplyvňujú enzymatickú reakciu.Berte do úvahy lineárny rozsah zariadenia (0,1–0,5 pre A260).

Existujú dva ďalšie užitočné javy: pomer bude asi o 0,3 nižší, keď sa A260/A280 meria vo vode;zatiaľ čo pomer meraný v 10 mM EDTA je asi o 0,2 vyšší ako pomer meraný v 1 mM EDTA.

Súvisiace produkty:

Výrobca a dodávateľ súpravy na izoláciu celkovej RNA v Číne |Foregene (foreivd.com)

Séria izolácie RNA Dodávatelia a továreň |Čínski výrobcovia izolačných sérií RNA (foreivd.com)

Séria izolácie RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)