Súprava na detekciu nukleových kyselín Escherichia coli O157:H7 (metóda fluorescenčnej sondy PCR)
Popis súpravy:
Kat.č.FP102
Používa sa na rýchlu detekciu a skríning E. coli O157:H7 vo vzorkách potravín, krmív, vody a vzoriek životného prostredia.
Popisy
Používa sa na rýchlu detekciu a skríning E. coli O157:H7 vo vzorkách potravín, krmív, vody a vzoriek životného prostredia.
[Princíp testovania]Podľa princípu fluorescenčnej PCR technológie sú špecifické priméry a Taqman sondy navrhnuté pre špecifický gén Escherichia coli O157: H7 a detegované fluorescenčným PCR prístrojom, aby sa realizovala detekcia Escherichia coli O157: H7 Kvalitatívna detekcia DNA.
Obsah súpravy
Poznámka: Kanálová sonda ROX nie je súčasťou dodávky.
| Csúčiastok | Špecifikácia | Qjednotnosť |
| Nárazník A | Trubica | 1 |
| Buffer B | Trubica | 1 |
| Pozitívna kontrola | Trubica | 1 |
| Negatívna kontrola | Trubica | 1 |
Očakávané použitie
Používa sa na rýchla detekcia a skríning E. coli O157:H7 vo vzorkách potravín, krmív, vody a vzoriek životného prostredia.
Podmienky skladovania a dátum spotreby
Skladujte pri teplote -20 °C v tme a vyhnite sa opakovanému zmrazovaniu a rozmrazovaniu.
Doba platnosti je 12mesiacov a dátum výroby je uvedený na vonkajšom obale.
Nástroje a spotrebný materiál
Fluorescenčný kvantitatívny PCR prístroj, pipetovacia pištoľ a zodpovedajúce hroty, vortexová trepačka, minicentrifúga.
Použitie
1. Spracovanie vzorky
1.1 Typ vzorky: Táto súprava je vhodná pre vzorky potravín, krmív, vody a iné vzorky s podozrením na kontamináciu Escherichia coli O157:H7.Pri hlboko spracovaných mäsových výrobkoch, nápojoch a iných látkach obsahujúcich pigmenty je potrebné ich opláchnuť, aby nedošlo k ovplyvneniu zberu fluorescenčného signálu.
1.2 Spracovanie vzorky: Informácie o príprave vzorky, obohatení kultúry a izolácii Escherichia coli O157: H7 nájdete v dokumente „GB 4789.10-2016 Národná štandardná potravinová mikrobiologická skúška bezpečnosti potravín Escherichia coli O157: H7 Test“.
- Nextrakcia kyseliny ukleovej
Vezmite 20 ml obohacovacieho roztoku do 1,5 ml centrifugačnej skúmavky, pridajte 200 μl mikrobiálneho lyzátu (vyžaduje sa dodatočná súprava), vortexujte 30 sekúnd, krátko odstreďte a odložte.
Poznámky: Extrakcia nukleovej kyseliny z lyzátu by mala byť dokončená do 10 minút a nemôže sa skladovať dlhší čas.
3. Amplifikácia nukleových kyselín
3.1 Na použitie zapnite fluorescenčný kvantitatívny PCR prístroj.
Pufer A a Pufer B zo súpravy, dôkladne ich roztopte a krátko odstreďte.Pridajte 18 μl tlmivého roztoku A a 2 μl tlmivého roztoku B do každej skúmavky PCR.Potom pridajte 5 ml každej negatívnej kontroly, extrahovanej nukleovej kyseliny a pozitívnej kontroly do skúmaviek PCR, skúmavky uzavrite a krátko odstreďte.
3.3 Preneste skúmavku s PCR reakciou do fluorescenčného zariadenia PCR a na vykonanie amplifikačných experimentov použite nasledujúce postupy: vyberte 25 ml pre reakčný systém, zbierajte fluorescenčné signály pri 60 °C pre každý cyklus a vyberte FAM pre detekčný kanál.
| Krok | Program | Počet cyklov |
| 1 | 37 ℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95 °C 15 s | 40 |
| 60 ℃ 30 s (zbierajte fluorescenciu) |
Návody na analýzu problémov
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Nie je možné extrahovať žiadnu RNA alebo je výťažok nukleovej kyseliny nízky
Zvyčajne existuje veľa faktorov, ktoré ovplyvňujú účinnosť regenerácie, ako napríklad: obsah RNA vzorky, spôsob operácie, elučný objem atď.
Analýza bežných príčin:
1. Ľadový kúpeľ alebo nízkoteplotné (4 ° C) odstreďovanie počas prevádzky.
Odporúčanie: Prevádzka pri izbovej teplote (15-25 °C), nikdy nie ľadový kúpeľ a nízkoteplotná odstredivka.
2. Nesprávne skladovanie vzorky alebo príliš dlhé skladovanie vzorky.
Návrh: Vzorky skladujte pri teplote -80 °C alebo zmrazte v tekutom dusíku a vyhnite sa opakovanému použitiu zmrazovania a rozmrazovania;skúste použiť čerstvo odobraté vzorky na extrakciu RNA.
3. Nedostatočná lýza vzorky
Odporúčanie: Uistite sa, že vzorka a pracovný roztok (lineárny akrylamid) boli dôkladne premiešané a inkubované 10 minút pri izbovej teplote (15-25 °C)
4. Eluent bol pridaný nesprávne
Odporúčanie: Uistite sa, že ddH2O bez RNázy je pridaná do stredu membrány čistiacej kolóny
5. Nesprávny objem bezvodého etanolu v pufri viRW2
Návrh: Postupujte podľa pokynov, pridajte správny objem bezvodého etanolu do pufra viRW2 a pred použitím súpravy ich dobre premiešajte.
6. Nesprávne použitie vzorky.
Návrh: 200 µl vzorky na 500 µl pufra viRL.Nadmerný objem vzorky bude mať za následok zníženú rýchlosť extrakcie RNA.
7. Nesprávny elučný objem alebo neúplná elúcia.
Návrh: Objem eluentu čistiacej kolóny je 30-50 μl;ak elučný efekt nie je uspokojivý, odporúča sa pridať predhriaty ddH bez RNázy2O a predĺžte čas umiestnenia pri izbovej teplote, napríklad 5-10 minút
8. Purifikačná kolóna obsahuje etanolový zvyšok po prepláchnutí v pufri viRW2.
Návrh: Ak po prepláchnutí v pufri viRW2 a centrifugácii v prázdnej skúmavke počas 2 minút stále zostáva etanol, purifikačnú kolónu možno po centrifugácii v prázdnej skúmavke ponechať 5 minút pri teplote miestnosti, aby sa úplne odstránil zvyšný etanol.
Degradácia purifikovaných molekúl RNA
Kvalita purifikovanej RNA súvisí s faktormi, ako je skladovanie vzorky, kontaminácia RNázou a prevádzka.
Analýza bežných príčin:
1. Odobraté vzorky neboli včas uložené.
Návrh: Ak sa vzorka nepoužije včas po odbere, ihneď ju uložte pri teplote -80 ℃ alebo v tekutom dusíku.Na extrakciu molekúl RNA sa snažte vždy, keď je to možné, použiť čerstvo odobraté vzorky.
2. Odobraté vzorky sa opakovane zmrazovali a rozmrazovali.
Odporúčanie: Počas odberu a skladovania vzoriek sa vyhnite opakovanému zmrazovaniu a rozmrazovaniu (nie viac ako raz), inak sa zníži výťažok nukleovej kyseliny.
3. Na operačnej sále bola zavedená RNáza alebo sa nenosili jednorazové rukavice, masky atď.
Návrh: Experiment s extrakciou molekúl RNA je najlepšie vykonať v samostatnej operačnej miestnosti RNA a experimentálny stôl sa pred experimentom vyčistí.Počas experimentu noste jednorazové rukavice a masky, aby ste sa vyhli degradácii RNA spôsobenej zavedením RNázy.
4. Činidlo je počas používania kontaminované RNázou.
Návrh: Vymeňte za novú súpravu na izoláciu vírusovej RNA pre súvisiace experimenty.
5. Kontaminácia centrifugačných skúmaviek, špičiek pipiet, atď. RNázou. Návrh: Uistite sa, že všetky centrifugačné skúmavky, špičky pipiet a pipety neobsahujú RNázu.
Purifikované molekuly RNA ovplyvnili následné experimenty
Molekuly RNA purifikované purifikačnou kolónou ovplyvnia následné experimenty, ak je príliš veľa soľných iónov alebo proteínov, ako napríklad: reverzná transkripcia, Northern Blot atď.
1. V eluovaných molekulách RNA sú zostávajúce ióny solí.
Odporúčanie: Uistite sa, že do pufra viRW2 bol pridaný správny objem bezvodého etanolu a premyte čistiacu kolónu dvakrát podľa správnej rýchlosti odstreďovania v návode na obsluhu；Ak stále zostávajú ióny solí, môžete pridať tlmivý roztok viRW2 do čistiacej kolóny a nechať ju pri izbovej teplote 5 minút.Potom vykonajte centrifugáciu, aby sa v čo najväčšej miere odstránila kontaminácia soľnými iónmi
2. V eluovaných molekulách RNA je zvyšný etanol
Návrh: Po potvrdení, že purifikačné kolóny boli premyté pufrom viRW2, vykonajte centrifugáciu v prázdnej skúmavke podľa odstredivej rýchlosti uvedenej v návode na obsluhu.Ak stále zostáva etanol, môže sa po centrifugácii v prázdnej skúmavke nechať 5 minút pri izbovej teplote, aby sa v čo najväčšej miere odstránil zvyšný etanol.
Návody na použitie:
Návod na použitie súpravy na izoláciu vírusovej RNA
