Je dobre známe, že v centrálnej dogme je RNA transkripčným mediátorom medzi expresiou DNA a proteínu.V porovnaní s detekciou DNA môže detekcia RNA objektívnejšie odrážať génovú expresiu v organizmoch.Experimenty zahŕňajúce RNA zahŕňajú: qRT-PCR, RNA-Seq a detekciu fúzneho génu atď. Na základe charakteristík samotnej RNA (cukrový kruh RNA má o jednu voľnú hydroxylovú skupinu viac ako cukrový kruh DNA), v spojení s veľkým počtom RNáz v prostredí je RNA nestabilnejšia a ľahšie sa degraduje ako DNA.Smeti dovnútra, odpadky von, ak kvalita RNA nie je dobrá, potom musia byť výsledky experimentu neuspokojivé, konkrétne sa prejavujú ako nepresné údaje alebo slabá opakovateľnosť.Spracovaniu RNA by sa preto mala venovať väčšia pozornosť a prepojenie kontroly kvality je tiež dôležitejšie na zabezpečenie presnosti a správnosti následných experimentálnych údajov.

Na kontrolu kvality RNA sa vo všeobecnosti používajú tieto bežne používané metódy:

• Spektrofotometria
• elektroforéza na agarózovom géli
• Bioanalyzátor Agilent
• fluorescenčná kvantitatívna PCR v reálnom čase
• Metóda fluorescenčného farbiva Qubit

01 Spektrofotometria

RNA má konjugované dvojité väzby a má absorpčný vrchol pri vlnovej dĺžke 260 nm.Podľa Lambert-Beerovho zákona môžeme vypočítať koncentráciu RNA z absorpčného vrcholu pri 260 nm.Čistotu RNA vieme navyše vypočítať aj podľa pomeru absorpčných píkov 260nm, 280nm a 230nm.280 nm a 230 nm sú absorpčné vrcholy proteínov a malých molekúl.Pomer A260/A280 a A260/A230 kvalifikovanej čistoty RNA by mal byť väčší ako 2. Ak je menší ako 2, znamená to, že vo vzorke RNA je kontaminácia proteínom alebo malou molekulou a je potrebné ju znova purifikovať.Zdroje kontaminácie ovplyvnia následné experimenty, ako je inhibícia účinnosti amplifikácie PCR reakcií, čo vedie k nepresným kvantitatívnym výsledkom.Čistota RNA má veľký vplyv na následné výsledky, takže spektrofotometria je vo všeobecnosti nevyhnutným článkom kontroly kvality v prvom kroku experimentov s nukleovými kyselinami.

Obrázok 1. Typické RNA/DNA absorpčné spektrum

02 Elektroforéza na agarózovom géli

Okrem čistoty je jedným z dôležitých ukazovateľov na posúdenie kvality RNA aj integrita RNA.Degradácia RNA povedie k veľkému počtu krátkych fragmentov vo vzorke, takže počet fragmentov RNA, ktoré možno efektívne detegovať a pokryť referenčnou sekvenciou, sa zníži.Integritu RNA je možné skontrolovať elektroforézou celkovej RNA na 1% agarózovom géli.Pri tejto metóde si môžete gél nakonfigurovať sami alebo použiť prefabrikovaný systém E-Gel™ na testovanie integrity.Viac ako 80 % celkovej RNA je ribozomálna RNA, z ktorej väčšinu tvorí 28S a 18S rRNA (v cicavčích systémoch).RNA dobrej kvality bude vykazovať dva zjavné svetlé pruhy, ktoré sú 28S a 18S svetlé pruhy, v tomto poradí, pri 5 Kb a 2 Kb, a pomer bude mať tendenciu blížiť sa k 2:1.Ak je v difúznom stave, znamená to, že vzorka RNA mohla byť degradovaná a na ďalšie testovanie kvality RNA sa odporúča použiť metódu opísanú neskôr.

Obrázok 2. Porovnanie degradovanej (dráha 2) a intaktnej RNA (dráha 3) na elektroforéze na agarózovom géli

03 Bioanalyzátor Agilent

Okrem vyššie opísanej metódy elektroforézy na agarózovom géli, ktorá nám môže pomôcť identifikovať integritu RNA jednoducho a rýchlo, môžeme na určenie integrity RNA použiť aj bioanalyzátor Agilent.Na posúdenie koncentrácie a integrity RNA využíva kombináciu mikrofluidiky, kapilárnej elektroforézy a fluorescencie.Použitím vstavaného algoritmu na analýzu profilu vzorky RNA môže bioanalyzátor Agilent vypočítať referenčnú hodnotu integrity RNA, číslo integrity RNA (ďalej len RIN) [1].Čím väčšia je hodnota RIN, tým vyššia je integrita RNA (1 je extrémne degradovaná, 10 je najkompletnejšia).Niektoré experimenty zahŕňajúce RNA naznačujú použitie RIN ako parametra na hodnotenie kvality.Ak vezmeme ako príklad vysokovýkonné sekvenčné experimenty (ďalej len NGS), usmernenia Oncomine™ Human Immune Repertoire, ktoré sa používajú na detekciu antigénových receptorov B buniek a T buniek v sérii panelov Thermo Fisher's Oncomine, naznačujú, že vzorky s hodnotami RIN väčšími ako 4, možno merať efektívnejšie hodnoty a klony (obrázok 3).Pre rôzne panely sú rôzne odporúčané rozsahy a často môže vyššie RIN priniesť efektívnejšie údaje.

Obrázok 3, v experimentoch Oncomine™ Human Immune Repertoire môžu vzorky s RIN väčším ako 4 detegovať efektívnejšie čítania a klony T buniek.【2】

Hodnota RIN má však aj určité obmedzenia.Hoci RIN má vysokú koreláciu s kvalitou experimentálnych údajov NGS, nie je vhodný pre vzorky FFPE.Vzorky FFPE boli dlho chemicky upravované a extrahovaná RNA má vo všeobecnosti relatívne nízku hodnotu RIN.To však neznamená, že efektívne údaje experimentu musia byť neuspokojivé.Na presné posúdenie kvality vzoriek FFPE musíme použiť iné merania ako RIN.Okrem RIN dokáže bioanalyzátor Agilent vypočítať aj hodnotu DV200 ako hodnotiaci parameter kvality RNA.DV200 je parameter, ktorý vypočítava podiel fragmentov väčších ako 200 bp vo vzorke RNA.DV200 je lepším indikátorom kvality vzorky FFPE ako RIN.Pre RNA extrahovanú pomocou FFPE má veľmi vysokú koreláciu s počtom génov, ktoré možno efektívne detegovať, a rozmanitosťou génov [3].Hoci DV200 môže nahradiť nedostatky v detekcii kvality FFPE, bioanalyzátor Agilent stále nedokáže komplexne analyzovať problémy s kvalitou vo vzorkách RNA, vrátane toho, či sú vo vzorkách inhibítory.Samotné inhibítory môžu ovplyvniť účinnosť amplifikácie následných experimentov a znížiť množstvo užitočných údajov.Aby sme vedeli, či je vo vzorke inhibítor, môžeme použiť metódu fluorescenčnej kvantitatívnej PCR v reálnom čase opísanú ďalej.

04 fluorescenčná kvantitatívna PCR v reálnom čase

Metóda fluorescenčnej kvantitatívnej PCR v reálnom čase dokáže nielen detekovať inhibítory vo vzorke, ale aj presne odrážať kvalitu RNA vo vzorke FFPE.V porovnaní s biologickými analyzátormi Agilent sú fluorescenčné kvantitatívne nástroje v reálnom čase obľúbenejšie vo veľkých biologických laboratóriách kvôli ich širšiemu použitiu.Na testovanie kvality vzoriek RNA nám stačí zakúpiť alebo pripraviť primérové ​​sondy pre interné referenčné gény, ako je GUSB (kat. č. Hs00939627).Použitím tejto sady primérov, sond a štandardov (celková RNA so známou koncentráciou) na vykonávanie absolútnych kvantitatívnych experimentov možno vypočítať efektívnu koncentráciu fragmentov RNA ako hodnotiaci štandard kvality RNA (skrátene funkčná kvantifikácia RNA (FRQ)).V teste NGS sme zistili, že FRQ vzoriek RNA má veľmi vysokú koreláciu s efektívnym objemom údajov.Pre všetky vzorky väčšie ako 0,2 ng/ul FRQ môže aspoň 70 % odčítaní účinne pokryť referenčnú sekvenciu (obrázok 4).

Obrázok 4, hodnota FRQ detegovaná fluorescenčnou kvantitatívnou metódou má veľmi vysokú koreláciu (R2>0,9) s efektívnymi údajmi získanými v experimente NGS.Červená čiara predstavuje hodnotu FRQ rovnajúcu sa 0,2 ng/ul (log10 = -0,7).【4】

Okrem toho, že je použiteľná na vzorky FFPE, metóda kvantitatívnej PCR v reálnom čase môže tiež účinne monitorovať inhibítory vo vzorkách.Vzorku na detekciu môžeme pridať do reakčného systému pomocou internej pozitívnej kontroly (IPC) a jej testu a potom vykonať fluorescenčnú kvantifikáciu, aby sme získali hodnotu Ct.Ak hodnota Ct zaostáva za hodnotou Ct v reakcii bez vzorky, znamená to, že inhibítor je prítomný vo vzorke a inhibuje účinnosť amplifikácie v reakcii.

05 Metóda fluorescenčného farbiva Qubit

Qubit Fluorometer je najčastejšie používané malé zariadenie na detekciu koncentrácie a čistoty nukleových kyselín, ktoré sa ľahko obsluhuje a existuje takmer v každom laboratóriu molekulárnej biológie.Presne vypočítava koncentráciu nukleovej kyseliny pomocou detekcie a fluorescenčného farbiva viažuceho nukleovú kyselinu (detekčné činidlo Qubit).Qubit má vysokú citlivosť a špecifickosť a dokáže presne kvantifikovať RNA až do koncentrácie pg/µL.Okrem dobre známej schopnosti presne kvantifikovať koncentráciu nukleových kyselín dokáže najnovší nový model Thermo Fisher, Qubit 4.0, tiež detekovať integritu RNA.Systém detekcie RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) deteguje integritu RNA súčasnou detekciou dvoch špecifických fluorescenčných farbív.Tieto dve fluorescenčné farbivá sa môžu viazať na veľké fragmenty a malé fragmenty RNA.Tieto dve fluorescenčné farbivá indikujú podiel veľkých fragmentov RNA vo vzorke a z toho možno vypočítať hodnotu IQ (Integrity and Quality) reprezentujúcu kvalitu RNA.Hodnota IQ je použiteľná pre FFPE aj non-FFPE vzorky a má veľký vplyv na následnú kvalitu sekvenovania.Ak vezmeme ako príklad experimenty NGS, v testovacích experimentoch RNA-Seq vykonaných na platforme Ion torrent™ mala väčšina vzoriek s hodnotami IQ väčšími ako 4 aspoň 50 % efektívnych meraní (obrázok 5).V porovnaní s vyššie uvedenými detekčnými metódami je Qubit IQ Assay nielen pohodlnejšie na obsluhu a trvá menej času (do piatich minút), ale má tiež veľkú koreláciu medzi nameranou hodnotou parametra IQ a kvalitou údajov následných experimentov.

Obrázok 5, existuje veľká korelácia medzi hodnotou Qubit RNA IQ a mapovanými hodnotami RNA-Seq.【5】

Prostredníctvom vyššie uvedeného úvodu verím, že každý dostatočne rozumie rôznym metódam kontroly kvality RNA.V praxi si môžete vybraťzodpovedajúcu metódu podľa typu vzorky a existujúcich nástrojov.Len dobrou kontrolou kvality RNA sa môžeme vyhnúť zlyhaniu následných experimentov spôsobených zlou kvalitou vzorky, čím ušetríme drahocenný čas, energiu a náklady.

Referenčné produkty:

Súprava na izoláciu zvieracej celkovej RNA

Súprava na izoláciu celkovej RNA buniek

referencie

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. a kol.RIN: číslo integrity RNA na priradenie hodnôt integrity k meraniam RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Užívateľská príručka Oncomine Human Immune Repertoire (č. publikácie MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Vylepšené metriky kvality pre hodnotenie RNA odvodenej z archívnych vzoriek tkaniva zaliateho do parafínu fixovaného vo formalíne, Toxicological Sciences, 7. vydanie, 2. vydanie, 27. august 300 ,https://doi.org/10.1093/toxsci/