Boli sme skúseným výrobcom.Získanie väčšiny v kľúčových certifikáciách svojho trhu za veľkú zľavu v Číne s vysokou citlivosťou One-Step Probe Rt-QpcrSúprava V2, Kvalita je život továrne, Zameranie na dopyt zákazníkov je zdrojom prežitia a rozvoja spoločnosti, Dodržiavame čestný a dobrý pracovný postoj a tešíme sa na váš príchod!
Boli sme skúseným výrobcom.Získanie väčšiny v kľúčových certifikáciách svojho trhuChina Taq DNA polymeráza, Qpcr, Naša spoločnosť sľubuje: rozumné ceny, krátky výrobný čas a uspokojivý popredajný servis, tiež vás vítame, aby ste navštívili našu továreň kedykoľvek budete chcieť.Prajeme si, aby sme teraz mali príjemné a dlhodobé spoločné podnikanie!!!

Popisy

Táto súprava využíva jedinečný systém lyzačného pufra, ktorý dokáže rýchlo uvoľniť RNA zo vzoriek kultivovaných buniek pre reakcie RT-qPCR, čím sa eliminuje časovo náročný a pracný proces purifikácie RNA.Templát RNA je možné získať len za 7 minút.Reagencie 5×Direct RT Mix a 2×Direct qPCR Mix-SYBR, ktoré sú súčasťou súpravy, môžu rýchlo a efektívne získať kvantitatívne výsledky PCR v reálnom čase.

5×Direct RT Mix a 2×Direct qPCR Mix-SYBR majú silnú toleranciu inhibítorov a lyzát vzoriek možno použiť priamo ako templát pre RT-qPCR.Táto súprava obsahuje unikátnu RNA vysokoafinitnú reverznú transkriptázu Foregene a Hot D-Taq DNA polymerázu, dNTPs, MgCl₂, reakčný pufor, PCR optimalizátor a stabilizátor.

technické údaje

200 × 20 μl Rxns, 1 000 × 20 μl Rxns

Komponenty súpravy

Vlastnosti a výhody

■ Jednoduché a efektívne: s technológiou Cell Direct RT je možné získať vzorky RNA len za 7 minút.

■ Požiadavka na vzorku je malá, možno otestovať len 10 buniek.

■ Vysoká priepustnosť: dokáže rýchlo detegovať RNA v bunkách kultivovaných v 384, 96, 24, 12, 6-jamkových platniach.

■ DNA Eraser môže rýchlo odstrániť uvoľnené genómy a výrazne znížiť vplyv na následné výsledky experimentov.

■ Optimalizovaný systém RT a qPCR robí dvojkrokovú reverznú transkripciu RT-PCR efektívnejšou a PCR špecifickejšou a odolnejšou voči inhibítorom reakcie RT-qPCR.

Aplikácia súpravy

Rozsah použitia: kultivované bunky.

- RNA uvoľnená lýzou vzorky: použiteľné len pre RT-qPCR templát tejto súpravy.

- Súpravu je možné použiť na nasledujúce účely: analýza génovej expresie, overenie efektu umlčania génov sprostredkovaného siRNA, skríning liekov atď.

Diagram

Skladovanie a trvanlivosť

Časť I tejto súpravy by sa mala skladovať pri teplote 4 °C;Časť II by sa mala skladovať pri teplote -20 °C.

Foregene Protease Plus II by sa mal skladovať pri 4 ℃, nezmrazovať pri -20 ℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR by sa mal skladovať pri teplote -20 °C v tme;pri častom používaní sa môže skladovať aj pri 4 °C na krátkodobé skladovanie (spotrebujte do 10 dní). Sme skúsený výrobca.Získanie väčšiny v kľúčových certifikáciách svojho trhu pre veľkú zľavu v Číne Vysoko citlivá jednokroková sonda Rt-Qpcr Kit V2, kvalita je život továrne, zameranie na dopyt zákazníkov je zdrojom prežitia a rozvoja spoločnosti, dodržiavame poctivosť a pracovný postoj v dobrej viere a tešíme sa na váš príchod!
Veľké zľavyChina Taq DNA polymeráza, Qpcr, Naša spoločnosť sľubuje: rozumné ceny, krátky výrobný čas a uspokojivý popredajný servis, tiež vás vítame, aby ste navštívili našu továreň kedykoľvek budete chcieť.Prajeme si, aby sme teraz mali príjemné a dlhodobé spoločné podnikanie!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.č.DRT-01021/01022

Pre bunkovú priamu RT-qPCR s použitím ≤ 1 000 000 buniek

Predstavenie výrobku

Tento produkt využíva jedinečný systém lýzového pufra na rýchle uvoľnenie RNA zo vzoriek kultivovaných buniek pre reakcie RT-qPCR, čím sa eliminuje časovo náročný a namáhavý proces purifikácie RNA a iba 7 minút na získanie požadovaného RNA templátu, s 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman poskytovaným súpravou môže rýchlo a efektívne získať kvantitatívne výsledky PCR v reálnom čase.

5× Direct RT Mix a 2× Direct qPCR Mix-Taqman majú silnú toleranciu voči inhibítorom a môžu vykonávať účinnú reverziu a špecifickú amplifikáciu pomocou lyzátu vzorky, ktorá sa má merať ako šablóny.Činidlo obsahuje Foregene reverznú transkriptázu, Hot D-Taq DNA polymerázu, dNTPs, MgCl₂, reakčný pufer, PCR Optimizer a stabilizátor, ktorý možno použiť s lyzačným pufrom na rýchlu a jednoduchú detekciu vzoriek a má vlastnosti vysokej citlivosti, špecifickosti a stability.

Vlastnosti produktu

Jednoduchá a efektívna technológia Cell Direct RT, ktorej získanie vzoriek RNA trvá len 7 minút.

Požiadavky na vzorky sú malé a na experimentovanie sa môže použiť minimálne 10 kultivovaných buniek.

Vysoká kapacita na rýchle získanie RNA z kultivovaných buniek, ako sú 384, 96, 24, 12 a 6-jamkové platne.

DNA Eraser je schopný rýchlo odstrániť uvoľnené genómy, čo výrazne znižuje vplyv na následné výsledky experimentov.

Optimalizované systémy RT a qPCR umožňujú dvojkrokovú RT-PCR s efektívnejšou reverznou transkripciou, špecifickosťou a silnejšou toleranciou inhibítora reakcie RT-qPCR.

Aplikácia súpravy

Rozsah použitia: Kultivované bunky.

RNA interpretovaná lýzou vzorky: používa sa len ako dvojkrokový templát RT-qPCR.

Súpravy možno použiť na nasledujúce účely: analýza regulačnej expresie génov, testovanie alel, skríning liekov atď.

Obmedzenia súpravy

Amplifikované fragmenty ≤ 300 bp.

Súpravy sa používajú na čerstvo kultivované bunky.

Kontrola kvality produktu

Podľa systému Total Quality Management System spoločnosti FOREGENE je každá šarža súprav série Cell Direct RT-qPCR viackrát prísne testovaná, aby sa zaistila spoľahlivosť a stabilita kvality každej šarže súprav.

Obsah súpravy

*:Bunková lýza, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman je možné zakúpiť samostatne, podrobnosti sú uvedené v Prílohe 1 (STRANA 13).

Podmienky skladovania

1. Dodacie podmienky

Celý proces prepravy boxu na ľad pri nízkej teplote, aby sa zabezpečilo, že súprava je v stave <4 °C.

2. Podmienky skladovania

Časť I skladujte pri teplote 4 °C a časť II pri teplote -20 °C.

Foregene Protease Plus II by sa mal skladovať pri teplote 4 °C, nie zmrazený pri teplote -20 °C.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman sa skladuje pri -20 °C alebo pri 4 °C na krátkodobé použitie, ak sa používa často (do 10 dní).

Informácie o komponentoch súpravy

Pufer CL: Poskytuje prostredie potrebné pre reakcie bunkovej lýzy.

Buffer ST: Ukončí účinnú látku v lyzáte, aby sa zabránilo účinkom na následnú RT.

DNA Eraser: Odstraňovač DNA, účinok odstránenia genómu na následné experimenty.

5× Direct RT Mix: Obsahuje Foregenovú reverznú transkriptázu s vysokou afinitou k RNA, inhibítor RNázy, dNTP, stabilizátory, zosilňovače, optimalizátory a priméry reverznej transkripcie pre optimálne zarovnanie (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: V kontexte lyzačného pufra sú bunky lyzované, aby sa uvoľnili nukleové kyseliny.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Toto činidlo obsahuje Hot D-Taq DNA polymerázu, dNTPs, MgCl₂reakčný pufor, PCR optimalizátor a stabilizátor.

Referenčné farbivo 20× ROX: Všeobecne sa používa na amplifikačných prístrojoch Real Time PCR od ABI, Stratagene a iných spoločností, používa sa na úpravu rozdielu medzi skúmavkami PCR a skúmavkami spôsobenými chybami v dávkovaní PCR.20× koncentrácia referenčného farbiva ROX potrebná pre rôzne nástroje je rôzna a používateľ ju môže pridať podľa odporúčanej koncentrácie nástroja.

ddH bez RNázy₂O: Sterilizovaná ultra čistá voda bez obsahu RNázy pre dvojstupňové reakcie RT-qPCR.

Prevencia:(Pred použitím súpravy si pozorne prečítajte bezpečnostné opatrenia)

Venujte pozornosť prevádzkovej metóde experimentu, aby ste predišli krížovej kontaminácii medzi vzorkami.

Dbajte na čistotu experimentálneho prostredia a náčinia, aby ste predišli kontaminácii RNázou a degradácii RNA.

Odoberte čerstvé alebo dobre konzervované vzorky buniek a nikdy nepoužívajte opakované vzorky buniek zmrazené a rozmrazené.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman by sa mal vyhnúť opakovanému zmrazeniu a rozmrazeniu, inak to ovplyvní reverznú transkripciu a účinnosť PCR.

Prepaprídelpredtýmprevádzka

Pred použitím tejto súpravy si pozorne prečítajte pokyny.Súprava Cell Direct RT-qPCR je jednoduchá, pohodlná a rýchla na obsluhu a pokyny poskytujú úplné informácie o celej súprave a o tom, ako ju správne používať.Pred použitím si pripravte potrebné experimentálne materiály a vybavenie.

Experimentálne materiály a vybavenie

◆ Kultivácia buniek.

◆ 1,5 ml alebo 2 ml, centrifugačná skúmavka bez RNázy/DNázy, hrot bez obsahu RNázy/DNázy, 0,2 ml sterilná skúmavka qPCR.

◆ qPCR stroj, pipeta, stolová odstredivka (≥13 400×g) (v závislosti od experimentálnych potrieb) atď.

Bezpečnosť

◆ Tento produkt slúži len na účely vedeckého výskumu, nepoužívajte ho na farmaceutické, klinické, potravinárske a kozmetické účely.

◆ Pri používaní chemikálií noste vhodné laboratórne oblečenie, rukavice, ochranné okuliare atď.

Prevádzkasprievodcov

Systémy bunkovej lýzy, systémy RT a doplnkové balenia reakčného roztoku qPCR je možné zakúpiť samostatne, podrobnosti nájdete v Prílohe 1 (STRANA 13).

Návod na obsluhu

A: Uvoľnenie vzorky RNA

1. Bunky boli vopred ošetrené: Premyte platňu s bunkovou kultúrou studeným PBS, potom bunky lyžujte (10-10⁶), 10⁶ Na extrakciu a purifikáciu RNA sa odporúča súprava na izoláciu buniek a RNA súpravu Total (DE-03111) alebo Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011).

1.1.Adherentné bunky (24-jamková platňa ako príklad)

1.1.1.Určite počet buniek v každej jamke, určite, že počet buniek je 1 × 10⁵a pomocou pipety odstráňte kultivačné médium z kultivačnej misky.

1.1.2.Do každej jamky pridajte 200 μl vopred vychladeného 1 x PBS.Nepipetujte opakovane a odstráňte PBS z jamiek.Nakloňte platňu a odstráňte čo najviac PBS.Pokračujte krokom 2.

1.1.3.Rôzne misky na kultiváciu buniek alebo referenčná tabuľka 1-1 v miske na kultiváciu buniek sa pridali vopred ochladené 1 x PBS na premytie buniek.

Tabuľka 1-1: Dávkovanie PBS pre rôzne počty buniek

Poznámka：Pre zaistenie pevnej priľnavosti buniek,pri umývaní sa zabráni veľkému počtu strát buniek.

1.2.Suspenzné bunky alebo adherentné bunky kultivované na neporéznych platniach

1.2.1.Adherentné bunky kultivované na platniach bez viacerých jamiek (suspenzné bunky začínajú od ďalšieho kroku 1.2.2), odoberajte a separujte bunky podľa normálnej metódy zberu buniek a umiestnite ich do kultivačnej platne alebo centrifugačnej skúmavky;ak sa použije trypsinizácia, vyžaduje sa centrifugácia na zber buniek a na odstránenie zvyškového trypsínu, do jednotlivých buniek sa pridali bunky resuspendované v PBS, aby sa bunky dispergovali.

1.2.2.Po spočítaní počtu buniek sa bunky rozdelili na alikvóty 1 x 10⁵ jednu do centrifugačných skúmaviek, odoberajte bunky centrifugáciou pri 1000 x g počas 10 minút.

1.2.3.Pridajte 200 μl PBS do centrifugačnej skúmavky, nepipetujte opakovane a priamo nasajte PBS.pokračujte krokom 2. (Ak je ťažké precipitovať a bunky boli znovu resuspendované, môže sa vykonať 1000 x g centrifugácia 10 minút po odstránení supernatantu, bunková peleta pokračuje krokom 2)

2. Bunková lýza: Odstráňte tlmivý roztok CL, jeho teplotu ekvilibrovanú na izbovú teplotu, DNA Eraser a Foregene Protease Plus II, podľa nasledujúcej tabuľky 1-2 pripravený lyzačný systém: (Lytický roztok je pripravený na použitie).

Tabuľka 1-2: štiepenie príprava systému (poznámka: pri príprave na ľade)

3.( 24-jamková platňa ako príklad) Do každej jamky napipetujte 200 μl základnej zmesi na lýzu buniek, 5-10-krát prefúknite, inkubujte pri izbovej teplote (20-25 °C) 5 minút.

Poznámka：Aby ste predišli tvorbe bublín, pri pipetovaní nastavte pipetu na 200 μl alebo menej.Bunky sa môžu po lýze zdať zakalené, čo je normálne.

4. (24-jamková platňa ako príklad) sa pridá do kvapaliny 20 μl tlmivého roztoku ST (rôzne lyzačné systémy, pridaný v množstve uvedenom v tabuľke 1-3), opakované pipetovanie 5-10 krát pri izbovej teplote (20-25 °C) sa inkubuje 2 minúty.

Poznámka：Špička pipety bola umiestnená pod povrchom, čím sa zabezpečilo pridanie lyzátu,aby sa predišlo tvorbe bublín, pri pipetovaní pipetovej stupnice bola nastavená na 200 μl alebo menej.

Tabuľka 1-3：Pridajte vyrovnávaciu pamäť ST

5. Lyzát sa použije na následné experimenty RT-qPCR.Ak nie je možné vykonať nasledujúce experimenty včas, ponechajte ho na ľade maximálne 2 hodiny a skladujte pri teplote -20 °C alebo -80 °C (nie viac ako tri mesiace).

B: Príprava systému RT

1.Vyberte 5 × Direct RT Mix a umiestnite ho na ľadový kúpeľ, nechajte prirodzene roztopiť a jemne premiešajte na neskoršie použitie;vyberte ddH2O bez RNázy a roztopte ju a umiestnite do ľadového kúpeľa na neskoršie použitie.Pripravte reakčný systém na ľade podľa tabuľky 2-1 uvedenej nižšie.

Tabuľka 2-1: Príprava RT reakčného systému

2. Po dokončení formulácie systému jemne premiešajte a krátko odstreďte podľa nasledujúcej tabuľky 2 -2 reakčné podmienky RT reakcia.

Tabuľka 2-2: Nastavenie podmienok reakcie RT

3. Po dokončení reakcie sa reakčný produkt umiestnil priamo na ľad pre qPCR, prosím, vložte dlhodobé konzervovanie -20 ℃ alebo -80 ℃.

Poznámka: V dôsledku použitia nepurifikovaného templátu sa v produkte reverznej transkripcie môžu objaviť biele precipitáty.Toto je normálny jav.Supernatant ihneď odstred'te na ďalšie experimenty.

Výsledný reakčný roztok RT sa pridá do ďalších reakčných systémov Step Real Time PCR, odporúča sa pridať množstvá v rozsahu od 10 do 30 % reakčného systému.

C: Príprava reakčného systému qPCR

1. Príslušné množstvo B pripraveného v kroku cDNA templát podľa nasledujúcej tabuľky 3-1 na prípravu reakčného systému.

Poznámka: Množstvo templátu cDNA predstavuje 10 – 30 % systému qPCR.Napríklad v systéme qPCR s objemom 20 μl pridajte 2 – 6 μl lyzačného pufra, ale nie viac ako 6 μl.

2. Optimalizácia dobrých podmienok qPCR (teplota žíhania, atď.) pre reakciu qPCR (reakčné podmienky uvedené v tabuľke 3-2).

Poznámka: Skúste použiť optimalizované podmienky pre reakcie qPCR, aby ste dosiahli lepšie výsledky.

Tabuľka 3-1: Príprava reakčného systému PCR

1*: Koncentrácia priméru môže byť upravená v rozsahu 50-900 nM, keď je reakcia priméru nízka.

Poznámka: Systém qPCR je možné upraviť podľa experimentálnych potrieb a modelu fluorescenčného cykléra.Pre qPCR v 50μl systéme, upravte dávku činidla proporcionálne podľa 20μl systém.

2*: Vyberte vhodnú konečnú koncentráciu referenčného farbiva ROX podľa fluorescenčného kvantitatívneho termocykléra.Najvhodnejšie koncentrácie referenčného farbiva ROX pre bežné fluorescenčné kvantitatívne cykléry sú uvedené v tabuľke nižšie:

Tabuľka 3-2: Sú poskytnuté reakčné podmienky qPCR

Poznámka: Na dosiahnutie najlepšieho účinku qPCR je možné použiť gradientovú PCR na optimalizáciu reakčných podmienok pre rôzne templáty a rôzne priméry.Podmienky PCR reakcie sa líšia v závislosti od fluorescenčného analyzátora, templátu, primeru atď. V konkrétnej operácii je potrebné navrhnúť optimálne reakčné podmienky podľa špecifických podmienok fluorescenčného kvantitatívneho tepelného cykléra, typu templátu, veľkosti požadovaného fragmentu, sekvencie báz amplifikovaného fragmentu a obsahu GC a dĺžky primerov, vrátane teploty žíhania, reakčného času atď.

Princípy návrhu primérov PCR v reálnom čase

Forward Primer a Reverse Primer

Pre Real Time PCR je veľmi dôležitý návrh priméru.Priméry súvisia so špecifickosťou a účinnosťou amplifikácie PCR a môžu byť navrhnuté s odkazom na nasledujúce princípy:

◆ Dĺžka priméru: 18-30 bp.

◆ Obsah GC: 40-60%.

◆ Hodnota Tm: Softvér na návrh základného náteru, ako napríklad Primer 5, môže poskytnúť hodnotu Tm základného náteru.Hodnoty Tm upstream a downstream primérov by mali byť čo najbližšie.Môže sa použiť aj vzorec na výpočet Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Pri vykonávaní PCR sa ako teplota nasadenia vo všeobecnosti vyberie teplota pod hodnotou Tm priméru 5 °C (zodpovedajúce zvýšenie teploty nasadenia môže zvýšiť špecifickosť reakcie PCR).

◆ Primery a produkty PCR:

◆ Navrhnutý primér Dĺžka amplifikačného produktu PCR je výhodne 100-150 bp.

◆ Navrhované primery v sekundárnej štruktúrnej oblasti šablóny by sa mali čo najviac vyhnúť.

◆ Vyhnite sa vytvoreniu 2 alebo viacerých komplementárnych báz medzi 3′ koncami upstream a downstream primerov.

◆ Primer 3′ svorkovnica nemôže byť prítomná s 3 ďalšími po sebe idúcimi G alebo C.

◆ Priméry samotné nemôžu mať komplementárne štruktúry, inak sa vytvorí vlásenková štruktúra, ktorá ovplyvňuje PCR amplifikáciu.

◆ ATCG by sa malo v sekvencii primérov distribuovať čo najrovnomernejšie a 3′ terminálna báza by sa mala vyhnúť ako T.

Dodatok1：Cell DirectRT-qPCR Komponent súpravyt doplnkové balenie

1. Roztok na lýzu buniek