RT-qPCR je vyvinutá z bežnej technológie PCR.Pridáva fluorescenčné chemikálie (fluorescenčné farbivá alebo fluorescenčné sondy) do tradičného reakčného systému PCR a deteguje proces žíhania a predlžovania PCR v reálnom čase podľa ich rôznych luminiscenčných mechanizmov.Zmeny fluorescenčného signálu v médiu sa používajú na výpočet množstva zmeny produktu v každom cykle PCR.V súčasnosti sú najbežnejšími metódami fluorescenčná farbiaca metóda a sondová metóda.

Metóda fluorescenčného farbiva:
Niektoré fluorescenčné farbivá, ako napríklad SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO atď., samy o sebe nevyžarujú svetlo, ale vyžarujú fluorescenciu po naviazaní na vedľajšiu drážku dsDNA.Preto na začiatku PCR reakcie nemôže zariadenie detekovať fluorescenčný signál.Keď reakcia postúpi do fázy žíhania-predlžovania (dvojstupňová metóda) alebo predlžovacej fázy (trojkroková metóda), dvojreťazce sa v tomto čase otvoria a nová DNA polymeráza Počas syntézy reťazca sa fluorescenčné molekuly kombinujú v malej drážke dsDNA a emitujú fluorescenciu.Ako sa počet cyklov PCR zvyšuje, stále viac farbív sa kombinuje s dsDNA a fluorescenčný signál sa tiež neustále zvyšuje.Vezmite si ako príklad SYBR Green Ⅰ.
Metóda sondy:
Sonda Taqman je najbežnejšie používaná sonda na hydrolýzu.Na 5′ konci sondy je fluorescenčná skupina, zvyčajne FAM.Samotná sonda je sekvencia komplementárna k cieľovému génu.Na 3′ konci fluorofóru je fluorescenčná zhášacia skupina.Podľa princípu prenosu fluorescenčnej rezonančnej energie (Försterov rezonančný prenos energie, FRET), keď reportérová fluorescenčná skupina (donorová fluorescenčná molekula) a zhášajúca fluorescenčná skupina (akceptorová fluorescenčná molekula) Keď sa excitačné spektrum prekrýva a vzdialenosť je veľmi blízka (7-10nm), excitácia donorovej molekuly môže indukovať autoorescenciu, fluorescenciu akceptovanej molekuly.Preto na začiatku PCR reakcie, keď je sonda voľná a neporušená v systéme, reportérová fluorescenčná skupina nebude emitovať fluorescenciu.Pri anelácii sa primér a sonda naviažu na templát.Počas fázy predlžovania polymeráza nepretržite syntetizuje nové reťazce.DNA polymeráza má 5′-3′ exonukleázovú aktivitu.Keď DNA polymeráza dosiahne sondu, hydrolyzuje sondu od templátu, oddelí reportérovú fluorescenčnú skupinu od zhášacej fluorescenčnej skupiny a uvoľní fluorescenčný signál.Keďže medzi sondou a templátom existuje vzťah jedna ku jednej, sondová metóda je lepšia ako metóda farbenia, pokiaľ ide o presnosť a citlivosť testu.

Obr. 1 Princíp qRT-PCR

Návrh základného náteru
Princípy:

Priméry by mali byť navrhnuté v konzervovanej oblasti série nukleových kyselín a mali by mať špecifickosť.

Najlepšie je použiť sekvenciu cDNA a prijateľná je aj sekvencia mRNA.Ak nie, zistite dizajn cds oblasti sekvencie DNA.
Dĺžka fluorescenčného kvantitatívneho produktu je 80-150 bp, najdlhší je 300 bp, dĺžka priméru je vo všeobecnosti medzi 17-25 bázami a rozdiel medzi upstream a downstream primérmi by nemal byť príliš veľký.

Obsah G+C je medzi 40% a 60% a 45-55% je najlepší.
Hodnota TM je medzi 58-62 stupňami.
Pokúste sa vyhnúť primérovým dimérom a autodimérom (neobjaví sa viac ako 4 páry po sebe idúcich komplementárnych báz) vlásenkovej štruktúre, ak je to nevyhnutné, urobte ΔG<4,5kJ/mol* Ak nemôžete zabezpečiť, že gDNA bola odstránená počas reverznej transkripcie Clean, je najlepšie navrhnúť priméry intrónu *3′ a vyhnúť sa kontinuálnej štruktúre G/G2, nemožno modifikovať G/G2 oblasti -3) primery a iné
špecifická Homológia heterogénne amplifikovanej sekvencie je výhodne menšia ako 70 % alebo má homológiu s 8 komplementárnymi bázami.
Databáza:
CottonFGD vyhľadávanie podľa kľúčových slov
Návrh základného náteru:
Návrh priméru IDT-qPCR

Obr.2 Stránka s online nástrojom na návrh základného náteru IDT

Obr3 zobrazenie stránky s výsledkami
Dizajn primérov lncRNA:
lncRNA:rovnaké kroky ako mRNA.
miRNA:Princíp metódy stem-loop: Keďže všetky miRNA sú krátke sekvencie s dĺžkou približne 23 nt, priamu PCR detekciu nie je možné vykonať, preto sa používa nástroj vlásenky so slučkou.Sekvencia stonky so slučkou je jednovláknová DNA s dĺžkou približne 50 nt, ktorá môže sama tvoriť vlásenkovú štruktúru.3 'Koniec môže byť navrhnutý ako sekvencia komplementárna k čiastočnému fragmentu miRNA, potom môže byť cieľová miRNA pripojená k sekvencii kmeňovej slučky počas reverznej transkripcie a celková dĺžka môže dosiahnuť 70 bp, čo je v súlade s dĺžkou amplifikovaného produktu určenou pomocou qPCR.Návrh priméru chvostovej miRNA.
Detekcia špecifická pre amplifikáciu:
Online blastová databáza: CottonFGD blast podľa podobnosti sekvencií
Local blast: Pozrite si použitie Blast+ na vykonanie lokálneho výbuchu, linux a macos môžu priamo vytvoriť lokálnu databázu, systém win10 je možné vykonať aj po inštalácii ubuntu bash.Vytvorte lokálnu databázu výbuchov a lokálny výbuch;otvorte ubuntu bash na win10.
Poznámka: Bavlna z horských oblastí a bavlna z morských ostrovov sú tetraploidné plodiny, takže výsledkom výbuchu budú často dva alebo viac zápasov.V minulosti používanie NAU cds ako databázy na vykonávanie blastu pravdepodobne nájde dva homológne gény s iba niekoľkými rozdielmi SNP.Zvyčajne sa dva homológne gény nedajú oddeliť dizajnom primeru, takže sa s nimi zaobchádza ako s rovnakými.Ak je zjavný indel, primér je zvyčajne navrhnutý na indeli, ale to môže viesť k sekundárnej štruktúre priméru. Voľná ​​energia sa zvyšuje, čo vedie k zníženiu účinnosti zosilnenia, ale tomu sa nedá vyhnúť.

Detekcia sekundárnej štruktúry primeru:
Kroky:otvoriť oligo 7 → zadať sekvenciu templátu → zatvoriť podokno → uložiť → nájsť primer na templáte, stlačením ctrl+D nastaviť dĺžku priméru → analyzovať rôzne sekundárne štruktúry, ako je samodimerizačné telo, heterodimér, vlásenka, nesúlad atď. Posledné dva obrázky na obrázku 4 sú výsledky testov primérov.Výsledok predného priméru je dobrý, nie je zrejmá žiadna dimérna a vlásenková štruktúra, žiadne súvislé komplementárne bázy a absolútna hodnota voľnej energie je menšia ako 4,5, zatiaľ čo zadný primér vykazuje spojitosť. 6 báz je komplementárnych a voľná energia je 8,8;okrem toho sa na 3′ konci objavuje vážnejší dimér a objavuje sa dimér 4 po sebe nasledujúcich báz.Hoci voľná energia nie je vysoká, 3 'dimér Chl môže vážne ovplyvniť amplifikačnú špecifickosť a účinnosť amplifikácie.Okrem toho je potrebné skontrolovať vlásenky, heterodiméry a nezhody.

Výsledky detekcie Obr. 3 oligo7
Detekcia účinnosti zosilnenia:
Účinnosť amplifikácie PCR reakcie vážne ovplyvňuje výsledky PCR.Aj pri qRT-PCR je účinnosť amplifikácie obzvlášť dôležitá pre kvantitatívne výsledky.Odstráňte ostatné látky, zariadenia a protokoly v reakčnom pufri.Kvalita primerov má tiež veľký vplyv na účinnosť amplifikácie qRT-PCR.Aby sa zaistila presnosť výsledkov, tak relatívna fluorescenčná kvantifikácia, ako aj absolútna fluorescenčná kvantifikácia musia detegovať účinnosť amplifikácie primérov.Uznáva sa, že efektívna účinnosť amplifikácie qRT-PCR je medzi 85 % a 115 %.Existujú dva spôsoby:
1. Metóda štandardnej krivky:
a.Zmiešajte cDNA
b.Gradientové riedenie
c.qPCR
d.Lineárna regresná rovnica na výpočet účinnosti zosilnenia
2. LinRegPCR
LinRegPCR je program na analýzu údajov RT-PCR v reálnom čase, nazývaných tiež údaje kvantitatívnej PCR (qPCR) založené na SYBR Green alebo podobnej chémii.Program používa údaje neopravené na základnú líniu, vykonáva korekciu základnej línie na každej vzorke samostatne, určuje okno linearity a potom používa lineárnu regresnú analýzu na prispôsobenie priamky cez súbor údajov PCR.Zo sklonu tejto čiary sa vypočíta účinnosť PCR každej jednotlivej vzorky.Priemerná účinnosť PCR na amplikón a hodnota Ct na vzorku sa používajú na výpočet počiatočnej koncentrácie na vzorku, vyjadrenej v ľubovoľných fluorescenčných jednotkách.Vstup a výstup údajov sa uskutočňuje prostredníctvom tabuľky programu Excel.Iba vzorka
je potrebné miešanie, žiadny gradient
sú potrebné kroky:(Vezmite si Bole CFX96 ako príklad, nie celkom stroj s jasným ABI)
experiment:ide o štandardný experiment qPCR.
Výstup údajov qPCR:LinRegPCR dokáže rozpoznať dve formy výstupných súborov: RDML alebo kvantifikácia Výsledok amplifikácie.V skutočnosti ide o detekčnú hodnotu čísla cyklu a fluorescenčného signálu v reálnom čase strojom a zosilnenie sa získa analýzou hodnoty zmeny fluorescencie účinnosti lineárneho segmentu.
Výber údajov: Teoreticky by mala byť použiteľná hodnota RDML.Odhaduje sa, že problém môjho počítača je v tom, že softvér nedokáže rozpoznať RDML, takže mám výstupnú hodnotu excel ako pôvodné dáta.Odporúča sa najskôr vykonať hrubý skríning údajov, ako napríklad zlyhanie pridania vzoriek atď. Body je možné vo výstupných údajoch vymazať (samozrejme, nemôžete ich vymazať, LinRegPCR bude tieto body v neskoršej fáze ignorovať)

Obr.5 Export údajov qPCR

Obr. 6 výber kandidátskych vzoriek

Vstup údajov:Otvorte výsledky amplifikácie kvalifikácie.xls, → otvorte LinRegPCR → súbor → prečítajte si z excelu → vyberte parametre, ako je znázornené na obrázku 7 → OK → kliknite na určenie základných hodnôt

Obr. 7 kroky vstupu dát linRegPCR

výsledok:Ak sa neopakuje, nie je potrebné zoskupovanie.Ak dôjde k opakovaniu, zoskupenie je možné upraviť vo vzorovom zoskupení a názov génu sa zadá do identifikátora a potom sa rovnaký gén automaticky zoskupí.Nakoniec kliknite na súbor, exportujte excel a zobrazte výsledky.Zobrazí sa účinnosť amplifikácie a výsledky R2 každej jamky.Po druhé, ak sa rozdelíte do skupín, zobrazí sa opravená priemerná účinnosť zosilnenia.Zabezpečte, aby účinnosť amplifikácie každého priméru bola medzi 85 % a 115 %.Ak je príliš veľký alebo príliš malý, znamená to, že účinnosť amplifikácie priméru je nízka.

Obr. 8 Výsledok a výstup údajov

Experimentálny proces:
Požiadavky na kvalitu RNA:
čistota:1.72,0 znamená, že môže existovať zvyškový izotiokyanát.Čistá nukleová kyselina A260/A230 by mala byť okolo 2 . Ak dôjde k silnej absorpcii pri 230 nm, znamená to, že existujú organické zlúčeniny, ako sú fenátové ióny.Okrem toho sa dá detegovať elektroforézou na 1,5 % agarózovom géli.Umiestnite marker, pretože ssRNA nemá žiadnu denaturáciu a logaritmus molekulovej hmotnosti nemá lineárny vzťah a molekulová hmotnosť sa nedá správne vyjadriť.Koncentrácia: Teoretickyniemenej ako 100 ng/ul, ak je koncentrácia príliš nízka, čistota je vo všeobecnosti nízka, nie vysoká

Obr. 9 RNA gél

Okrem toho, ak je vzorka vzácna a koncentrácia RNA je vysoká, odporúča sa ju po extrakcii rozdeliť na alikvóty a zriediť RNA na konečnú koncentráciu 100-300 ng/ul na reverznú transkripciu.Inproces reverznej transkripcie, keď je mRNA transkribovaná, oligo (dt) priméry, ktoré sa môžu špecificky viazať na polyA konce, sa používajú na reverznú transkripciu, zatiaľ čo lncRNA a circRNA používajú náhodné hexamérne (Random 6 mer) priméry na reverznú transkripciu celkovej RNA Pre miRNA sa na reverznú transkripciu používajú priméry špecifické pre miRNA.Mnohé spoločnosti teraz uviedli na trh špeciálne súpravy na odkalovanie.Pre metódu stonkovej slučky je metóda chvostovania pohodlnejšia, vysoko výkonná a šetrí činidlo, ale účinok rozlíšenia miRNA rovnakej rodiny by nemal byť taký dobrý ako metóda stonkovej slučky.Každá súprava reverznej transkripcie má požiadavky na koncentráciu génovo špecifických primerov (stem-loops).Interná referencia použitá pre miRNA je U6.V procese inverzie stonky a slučky by sa trubica U6 mala obrátiť oddelene a predný a zadný základný náter U6 by sa mal pridať priamo.CirRNA aj lncRNA môžu používať HKG ako internú referenciu.Indetekcia cDNA,
ak nie je problém s RNA, cDNA by mala byť tiež v poriadku.Ak však ide o dokonalosť experimentu, je najlepšie použiť interný referenčný gén (referenčný gén, RG), ktorý dokáže rozlíšiť gDNA od cd.Vo všeobecnosti je RG gén pre domácnosť.HKG), ako je znázornené na obrázku 10;V tom čase som vyrábal zásobný proteín zo sójových bôbov a ako internú referenciu som použil aktín7 obsahujúci intróny.Veľkosť amplifikovaného fragmentu tohto priméru v gDNA bola 452 bp, a ak bola cDNA použitá ako templát, bola 142 bp.Potom výsledky testu zistili, že časť cDNA bola skutočne kontaminovaná gDNA, a tiež dokázali, že s výsledkom reverznej transkripcie nebol problém a mohla byť použitá ako templát pre PCR.Je zbytočné uskutočňovať elektroforézu na agarózovom géli priamo s cDNA a ide o difúzny pás, ktorý nie je presvedčivý.

Obr. 10 detekcia cDNA

Stanovenie podmienok qPCRvo všeobecnosti nie je problém podľa protokolu súpravy, hlavne v kroku hodnoty tm.Ak niektoré priméry nie sú dobre navrhnuté počas návrhu primérov, čo vedie k veľkému rozdielu medzi hodnotou tm a teoretickými 60 °C, odporúča sa cDNA po zmiešaní vzoriek spustiť gradientovú PCR s primérmi a snažiť sa vyhnúť nastaveniu teploty bez pásov ako hodnoty TM.

Analýza dát

Konvenčná metóda kvantitatívneho spracovania PCR relatívnej fluorescencie je v zásade podľa 2-ΔACT.Šablóna spracovania údajov.

Súvisiace produkty:

Jednoduché PCR v reálnom čase^TM – Taqman

Jednoduché PCR v reálnom čase^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix pre syntézu prvého vlákna cDNA)

RT Easy II (Master Premix pre syntézu prvého vlákna cDNA pre qPCR)