Experiment RT-qPCR zahŕňa extrakciu RNA a hodnotenie kvality, reverznú transkripciu a qPCR v troch krokoch, pričom každý krok má veľa opatrení, ktoré podrobne predstavíme nižšie.

Ⅰ.Hodnotenie kvality RNA

V experimente RT-qPCR je po dokončení extrakcie RNA potrebné vyhodnotiť kvalitu RNA a následný experiment je možné vykonať až po jeho kvalifikácii.Medzi vyhodnocovacie metódy patrí spektrofotometer, gélová elektroforéza Agilent, analýza Agilent 2100, medzi ktorými je najčastejšie používaný spektrofotometer a metóda detekcie agarózovým gélom.Je potrebné poznamenať, že tieto dve metódy je potrebné použiť spoločne na dokončenie detekcie a analýzy koncentrácie, čistoty a integrity RNA, aby sa zabezpečila kvalita RNA.

Súvisiaca súprava na izoláciu RNA: 

Súprava na izoláciu celkovej RNA buniek

Vysoko purifikovanú a kvalitnú celkovú RNA je možné získať z rôznych kultivovaných buniek za 11 minút.

Súprava na izoláciu zvieracej celkovej RNA

Rýchlo a efektívne extrahujte vysoko čistú a kvalitnú celkovú RNA z rôznych živočíšnych tkanív.

Spektrofotometer:

Spektrofotometer sa používa hlavne na stanovenie koncentrácie a čistoty RNA, ale nedokáže zistiť integritu RNA a genómového zvyšku.Medzi nimi sú A260/280 a A260/230 dôležité parametre na detekciu čistoty RNA a čistotu RNA možno detegovať podľa kolísania ich hodnôt:

1. 1,9 < A260/280 < 2,1, čo naznačuje, že čistota RNA je dobrá;A260/280 <1,9, čo naznačuje, že v RNA môže byť proteínový zvyšok;A260/280>2.1, čo naznačuje možnú čiastočnú degradáciu RNA, ktorá môže byť ďalej potvrdená elektroforézou na agarózovom géli.

2. 2,0 < A260/230 < 2,2, čo naznačuje, že čistota RNA je dobrá;A260/230 < 2,0, čo naznačuje, že v RNA môžu byť zvyšky organických činidiel, ako sú fenoly, etanol alebo cukry.

Elektroforéza na agarózovom géli:

Elektroforéza na agarózovom géli môže analyzovať integritu RNA, genómové a proteínové zvyšky, ale nedokáže presne kvantifikovať koncentráciu RNA ani detegovať zvyšky organických činidiel.Vezmite si napríklad eukaryotické RNA templáty:

1. RNA bola podrobená elektroforéze na agarózovom géli.Ak na gélovej mape boli iba tri jednotlivé pásy 28sRNA, 18sRNA a 5,8sRNA, znamená to, že extrahovaná RNA je neporušená.Ak dôjde k javu ťahania, znamená to čiastočnú degradáciu RNA.

2. Ak je medzi otvorom lepidla a pásikom 28sRNA jeden svetlý pás, môže tam byť zvyšok genómovej DNA.

3. Ak sa v otvore lepidla objavia pásy, znamená to, že tam môžu byť zvyšky bielkovín a iných makromolekulárnych látok.

Ⅱ. Reverzná transkripcia

Po dokončení extrakcie RNA je potrebné ju previesť na cDNA pre nasledujúce experimenty, takže krok reverzácie je nevyhnutný.Reverzná transkripcia bude zavedená z výberu reverznej transkriptázy a primeru:

Výber reverznej transkriptázy:

Typické reverzné transkriptázy zahŕňajú AMV RTázu a MMLV RTázu.RNáza H AMV RTázy má silnú aktivitu, krátku dĺžku syntézy, nízke množstvo syntézy a dobrú tepelnú stabilitu (42 ~ 55 °C).Aktivita RNázy H MMLV RTázy je slabá, dĺžka syntézy je dlhá, množstvo syntézy je vysoké a tepelná stabilita je slabá (37 ~ 42 °C).

Pretože enzým RNáza H má funkciu degradácie templátu RNA, pri reverznej transkripcii by sa mal prednostne vyberať MMLV so slabou aktivitou RNázy H a po neskoršom genetickom inžinierstve dosiahla tepelná stabilita MMLV kvalitatívny skok.Užívanie ForegeneForeasy reverzná transkriptáza (M-MLV pre reverznú transkripciu) ako príklad je to nová reverzná transkriptáza exprimovaná v E. coli upravených baktériách s použitím technológie genetickej rekombinácie.Je to rekombinantná DNA polymeráza, ktorá syntetizuje komplementárne vlákno DNA z jednovláknovej RNA, DNA alebo hybridu RNA:DNA.Nemá žiadnu aktivitu RNázy H, silnú stabilitu, silnú afinitu k RNA a vysokú citlivosť detekcie.

 

Foreasy reverzná transkriptáza (M-MLV pre reverznú transkripciu)

Výber základného náteru:

Vo všeobecnosti RT priméry spadajú do troch kategórií: oligo dT, náhodné priméry a génovo špecifické priméry.Vyberte vhodné primery na použitie podľa rôznych experimentálnych požiadaviek.

1. Ak je templát eukaryotického pôvodu a neskorá cDNA sa používa na rutinnú PCR amplifikáciu, odporúča sa Oligo (dT);Ak sa následný experiment použije len pre qPCR, odporúča sa zmiešať Oligo (dT) s náhodnými primérmi, aby sa zlepšila účinnosť reverznej transkripcie.

2. Ak je templát z prokaryotov, na reverznú transkripciu by sa mali vybrať náhodné priméry alebo génovo špecifické priméry.

Ⅲ.qPCR

Kvantifikácia fluorescencie je vypracovaná najmä z výberu kvantitatívnych metód, princípov návrhu primerov, výberu ROX, konfigurácie reakčného systému a nastavenia reakčných podmienok atď.

Výber kvantitatívnych metód:

Kvantitatívne metódy sa delia na relatívne kvantitatívne metódy a absolútne kvantitatívne metódy.Relatívna kvantifikácia sa môže použiť na detekciu vplyvu určitých liečebných metód na génovú expresiu, detekciu rozdielov v expresii génov v rôznych časoch a porovnanie rozdielov v expresii génov v rôznych tkanivách.Absolútnou kvantifikáciou je možné zistiť množstvo nukleovej kyseliny vo víruse atď.Pri pokusoch musíme zvoliť vhodné kvantitatívne metódy podľa vlastných pokusov.

Princípy návrhu základného náteru:

Návrh priméru pre qPCR priamo súvisí s účinnosťou amplifikácie a špecifickosťou produktu.Preto je správne navrhnutie dobrých primerov prvým krokom úspešnej qPCR.Pri návrhu základného náteru by sa pri dodržiavaní princípu konvenčného návrhu základného náteru mali dbať na nasledujúce zásady:

1. Dĺžka cieľového fragmentu je riadená medzi 100 a 300 bp;

2. Návrh krížového exónu, aby sa zabránilo vplyvu genómovej DNA;

3. Navrhnuté priméry je potrebné testovať na účinnosť amplifikácie a až keď účinnosť amplifikácie dosiahne štandard (90-110 %), môžu sa použiť na kvantitatívne experimenty;

4. Koncentrácia primeru je zvyčajne optimalizovaná medzi 0,1 uM a 1,0 uM.

Výber zROX:

V procese kvantitatívnej reakcie môže ROX rovnomerne upraviť rozdiel optickej dráhy, chybu pipetovania alebo rozdiel v objeme spôsobený odparovaním a kondenzáciou, čím sa zlepšuje opakovateľnosť výsledkov.Treba však poznamenať, že výber ROX súvisí s nástrojom.Ak má prístroj qPCR funkciu automatickej korekcie rozdielu medzi otvormi, nie je potrebné pridávať ROX;v opačnom prípade je potrebné pridať korekciu ROX.Malí partneri pri nákupe činidiel musia podľa použitého prístroja zvoliť správny ROX, vyvarovať sa neskorším chybám.

Príprava reakčného systému:

Výhodné sú reakčné objemy 20 ul a 50 ul.Pri formulovaní systému je potrebné venovať pozornosť týmto veciam:

1. Reakčný systém je potrebné pripraviť ventiláciou na ultračistom pracovnom stole, nový ddH₂O sa používa pre každý experiment;

2. Každý experiment musí pripraviť NTC na overenie, či je v systéme znečistenie, a každý pár primérov musí urobiť NTC pri príprave systému;

3. Na zistenie, či je v templáte RNA prítomný zvyšok gDNA, možno pre každú vzorku na detekciu pripraviť NRT;

4. Pri príprave systému sa odporúča vykonať aspoň 3 technické opakovania pre jednu vzorku;

5. Keď je templátom cDNA, odporúča sa riediť 5-10 krát, aby sa znížil inhibičný účinok systému reverznej transkripcie na experiment qPCR.Je lepšie preskúmať množstvo šablóny pomocou gradientu, aby hodnota CT klesla medzi 20-30;

6. Stanovte požadovaný počet reakcií, zvýšte o 5-10 % na základe počtu reakcií a vypočítajte číslo konfigurácie objemu;

7, systém sa pripravuje pomocou princípu premixu, miešania po odstredení a zabezpečuje, aby nevznikli bubliny;

8, Pokiaľ je to možné, vyberte si podporný spotrebný materiál.

Súvisiaca súprava RT-qPCR