Každý hovorí o princípe experimentu qRT-PCR, návrhu primeru, interpretácii výsledkov atď., ale myslím si, že by som sa s vami mal podeliť o experimentálne fungovanie qRT-PCR.Je to málo, ale ide o výsledky.
Pred vykonaním qRT-PCR musíme jasne pochopiť našu vlastnú RNA a prevádzkové metódy.Koniec koncov, naše úsilie je zamerané skôr na dosiahnutie výsledkov, než na jednoduché cvičenie.Takže pred vykonaním qRT-PCR musíme určiť nasledujúce problémy (niektoré z nich sa vzťahujú iba na SYBR).
1 Ste si istý, že vaša RNA nie je degradovaná?
NanoDrop 2000 dokáže detekovať iba koncentráciu a čistotu RNA, ale nedokáže zistiť integritu RNA.
Hodnota RNA (RNA Intesity Number) môže odrážať integritu RNA, ktorú deteguje systém Agilent 2100 Bioanalyzer.
Obr Schematický diagram hodnôt RIN pre rôzne vzorky RNA (eukaryoty) Obr.
Laboratóriá však vo všeobecnosti nemajú Agilent 2100 Bioanalyzer.V tomto prípade môžeme detegovať cez formaldehydový gél, ale požiadavka na celkové množstvo RNA je vysoká, takže najrýchlejšou metódou je použitie bežnej gélovej elektroforézy.Vyžaduje sa, aby bol v prostredí bez nukleáz, preto je potrebné prepláchnuť elektroforéznu nádrž, fľašu so sol, držiak gélu a hrebeň vodou DEPC.Agaróza je tiež bez nukleáz (pokiaľ je čerstvo otvorená) a zavádzací pufer by mal byť čerstvo otvorený, pokiaľ je to možné, s 1,2 % gélom.
Všimnite si, že gél musí byť úplne rozpustený, inak spôsobí nehomogénne pásy, ako je znázornené na vzorke 9 na obrázku.Ak je napätie príliš vysoké alebo ak beží príliš dlho, generuje teplo a spôsobí degradáciu RNA, takže napätie a čas by mali byť primerane kontrolované.Okrem toho môže beh gélu ďalej určiť, či je vo vzorke zvyšok DNA, a sledovať, či je v dávkovacej nádobke veľký počet zadržaných pásikov.
Obrázok.Detekcia RNA gélovou elektroforézou
2 Ste si istý koncentráciou vašej cDNA?
Skúsenosť veľkých bratov v laboratóriu je taká, že cDNA 20 ul systému získaná každou inverziou sa priamo riedi 20X, zatiaľ čo postdoktorandské sestry sa riedia 10X.Väčšinou závisím od situácie.Pretože kvalita RNA, o ktorej sa zmieňuje každý človek, je iná, úroveň zvrátenia je tiež odlišná a technológia reverzácie nemusí byť stabilná.
Takže zakaždým, keď získam reverznú cDNA, najskôr ju asi 3-krát zriedim a potom použijem housekeepingový gén na vykonanie RT-PCR, počet cyklov je vo všeobecnosti 25 cyklov, na identifikáciu špecifickej koncentrácie a potom určím konečný faktor riedenia.
3 Ste si istý, že sa vaše primery ľahko používajú?
Môže prejsť krivkou topenia qRT-PCR, ale stále to stojí peniaze.Pre laboratóriá bez veľkých peňazí, keď dostanú veľa primérov, môžu použiť obyčajnú RT-PCR, aby zistili, či ide o jeden pás a identifikovali špecifickosť primérov.Ak laboratórium nemá nedostatok peňazí, špecifickosť všetkých primérov možno identifikovať raz pomocou krivky topenia.
4 Ste si istý, že vaše experimentálne podmienky sú vhodné?
SYBR by mal byť chránený pred silným svetlom, preto sa pokúste vypnúť stropné svetlo pri pridávaní činidla SYBR a na dokončenie stačí použiť tlmené svetlo.
Skladujte SYBR pri teplote 4 °C.Pri použití jemne prevracajte nahor a nadol, aby sa dobre premiešal, aby sa zabránilo peneniu, a nevírte prudko.
Niektoré mladšie sestry radi kreslia značky na dosku PCR zo strachu, že si pomiešajú vzorky, čo je nesprávne.Pretože vaše markery s veľkou pravdepodobnosťou ovplyvnia zber fluorescenčných signálov, vo všeobecnosti odporúčam juniorom používať experimentálne notebooky na pomoc s pamäťou, ako je uvedené nižšie.
Obrázok.Schéma načítania vzorky qRT-PCR
5 Si si istý, že to robíš správne?
Nezabudnite nosiť rukavice, nosiť rukavice, nosiť rukavice a trikrát povedať dôležité veci.
Aby som znížil vystavenie SYBR svetlu, osobne by som chcel najskôr pridať šablónu, ako je znázornené na obrázku nižšie.Podľa skúseností pridanie malého množstva šablóny pravdepodobne spôsobí chyby pri vzorkovaní.Preto, aby sa minimalizovala chyba spôsobená pridaním malého množstva šablóny, zvyčajne vzorku znova zdvojnásobím a pri pridávaní vzorky zdvojnásobím množstvo, aby sa znížilo množstvo pridaného H2O2.
Obrázok.Schematický diagram načítania qRT-PCR
Potom nakonfigurujte systém qRT-PCR nasledovne.
Obrázok.Schéma prípravy systému qRT-PCR
POZNÁMKA: Proces konfigurácie je potrebné vykonať na ľade.
Po pridaní vzorky prilepte priehľadnú tesniacu fóliu.Snažte sa nedotýkať sa rukami povrchu priehľadnej tesniacej fólie, jednoducho ovládajte z priestoru na oboch stranách fólie.Pretože odtlačky prstov môžu tiež ovplyvniť zber fluorescenčných signálov.Potom pomocou centrifúgy rýchlo odstreďujte 10 s pri nízkej rýchlosti, aby ste zabránili tomu, aby vzorka visela na stene.
Súvisiace produkty:
Čas odoslania: 28. apríla 2023
