RT-qPCR je základným experimentom molekulárnej biológie a každý ho musí poznať.Zahŕňa hlavne tri kroky: extrakciu RNA, reverznú transkripciu do cDNA a fluorescenčnú kvantitatívnu PCR v reálnom čase.Nepomáha, čo sa deje?Je pravdepodobné, že sa vyskytol problém sexperiment s reverznou transkripciou!Aj keď sa zdá, že experiment s reverznou transkripciou potrebuje iba pridať RNA, dNTP, priméry areverznej transkriptázydo centrifugačnej skúmavky a dobre premiešajte, ale v samotnom prevádzkovom procese je ešte veľa detailov, ktorým je potrebné venovať pozornosť.Poďme sa o tom dozvedieť!

Ako posúdiť kvalitu RNA?
Na získanie cDNA je rozhodujúca kvalita RNA!Kvalitu RNA možno zistiť hlavne z dvoch hľadísk:
(1) Integrita RNA:Integritu RNA je možné overiť elektroforézou na agarózovom géli. Ak vezmeme ako príklad eukaryoty, úplná celková RNA má tri jasné pásy, molekulové hmotnosti od veľkých po malé sú 28S, 18S a 5S a 28S je dvakrát jasnejší ako 18S;ak sú viditeľné tri pásy, ale typ pásu je rozmazaný alebo difúzia znamená, že RNA je čiastočne degradovaná.V tejto chvíli okamžite vykonajte reverznú transkripčnú reakciu a primerane zvýšte vstup šablóny;ak je možné vidieť iba pás s nízkou molekulovou hmotnosťou alebo žiadny pás, RNA bola úplne degradovaná a je potrebné ju znova extrahovať.Agilent 2100 indikuje integritu RNA s diagramom vrcholu a hodnotou RIN.Ak je nukleová kyselina neporušená, základná línia elektroferogramu je plochá;ak je nukleová kyselina vážne degradovaná, základná línia je nerovnomerná a objavuje sa viac degradačných píkov;hodnota RIN odráža integritu RNA, v rozsahu 0-10, čím väčšia hodnota, tým lepšia kvalita RNA.No, čím vyšší je stupeň úplnosti.
(2) Čistota RNA:Pomer OD260/280 je možné detegovať UV spektrofotometriou.Ak je pomer OD260/280 medzi 1,9 a 2,1, čistota je veľmi dobrá.
Zvyšková genómová DNA môže viesť k nepresným kvantitatívnym výsledkom
Keď sa extrahuje RNA, získaná RNA sa môže zmiešať s genómovou DNA (gDNA), ktorá nebola vyčistená.Preto bude cDNA po reverznej transkripcii tiež zmiešanágDNA.Počas dolného tokuqPCRreakcia,cDNAa gDNA môžu byť amplifikované súčasne, čo vedie k relatívne nízkej hodnote CT, takže výsledky môžu byť skreslené.
Čo by sme teda mali v tejto situácii robiť?Foregenenavrhuje:
(1) Vykonajte čistenie genómu na reverznej RNA, ktorú možno odstrániť extrakciou z kolóny počas extrakcie RNA;
(2) Spracujte extrahovanú RNA s DNázouI , ale ukončite ho EDTA;
reverzných transkripčných činidiels modulmi na čistenie genómu;

Ako si vybrať primery pre reverznú transkripciu?
Priméry reverznej transkripcie tiež ovplyvňujú výsledok reakcie reverznej transkripcie.Na reverznú transkripciu si môžete vybrať náhodné priméry, Oligo dT alebo génovo špecifické priméry podľa špecifických okolností experimentu:
(1) Špecifické prepisy: odporúčajú sa génovo špecifické priméry;
(2) Prepisy dlhých fragmentov: Odporúčajú sa oligo dT/génovo špecifické priméry;
(3) Interné fragmenty prepisov dlhých segmentov: génovo špecifické priméry/náhodné priméry/náhodné priméry + Oligo dT.Ak sa vykoná následný experiment qPCR, Oligo dT nemožno použiť samostatne, pretože použitie samotného Oligo dT môže spôsobiť skreslenie 3' konca, čo vedie k nepresným výsledkom experimentu qPCR;
(4) miRNA: Môžu sa použiť primery so stopkou alebo tailing primery.

Koľkokrát by sa mala cDNA produktu reverznej transkripcie zriediť na kvantifikáciu?
Po získaní cDNA produktu reverznej transkripcie je veľmi dôležité, koľkokrát by sa mala cDNA zriediť pre experimenty qPCR.Ak je koncentrácia cDNA príliš vysoká alebo príliš nízka, účinnosť amplifikácie môže byť ovplyvnená.Dá sa zmerať koncentrácia cDNA a ako by sa to malo robiť?
(1) Koncentráciu cDNA produktu reverznej transkripcie nemožno merať, pretože okrem produktu cDNA obsahuje produkt reverznej transkripcie aj zvyškový pufer reverznej transkripcie, reverznú transkriptázu, priméry atď., ktoré budú interferovať s výsledkami merania koncentrácie a spôsobia abnormálny výťažok OD260/280, OD260/230, a preto neodráža skutočný pomer cDNA.V tomto čase niektorí priatelia povedia, potom zmeriam koncentráciu po očistení;tu, Foregene by rád pripomenul, že cDNA sa neodporúča purifikovať, pretože dĺžka cDNA získaná reverziou je iná a krátka cDNA sa pri čistení stratí.
(2) Čo teda robiť?Pred experimentom qPCR je možné určiť gradient riedenia cDNA prostredníctvom predexperimentu.Napríklad: použite zásobný roztok cDNA, 10-násobné riedenie a 100-násobné riedenie ako šablóny pre qPCR experimenty a vyberte faktor riedenia s hodnotou CT v rozsahu 18-28.

Ako by mali byť miRNA reverzne transkribované?
miRNA je jednovláknová RNA s malou molekulou s veľkosťou približne 22 nt, ktorá nekóduje proteín.Kvôli svojej krátkej dĺžke je konvenčná metóda qPCR ťažké ju priamo kvantifikovať, takže je často potrebné rozšíriť miRNA;bežne používané metódy reverznej transkripcie pre miRNA zahŕňajú metódu stem-loop a metódu chvostovania.
Metóda vlásenky so slučkou je rozšírenie miRNA pridaním primérov vlásenky.Táto metóda detekcie má vyššiu citlivosť a špecifickosť, ale priepustnosť detekcie je nízka.Jedna reverzná transkripcia môže detegovať iba jednu miRNA a internú referenciu;metóda pridávania chvosta je zložená z dvoch Je ukončená spoločným pôsobením dvoch enzýmov, ktorými sú PolyA polymeráza a reverzná transkriptáza.PolyA polymeráza je zodpovedná za pridanie PolyA chvostov k miRNA na zvýšenie jej dĺžky a reverzná transkriptáza vykonáva reverznú transkripčnú reakciu.Táto metóda má vysokú priepustnosť detekcie a dokáže detegovať viacero miRNA a interných referencií v jednej reverznej transkripcii, ale senzitivita a špecifickosť sú pri metóde s kmeňovou slučkou nízke.