Real Time PCR, tiež známa ako kvantitatívna PCR alebo qPCR, je metóda na monitorovanie a analýzu produktov amplifikácie PCR v reálnom čase.
Pretože kvantitatívna PCR má výhody jednoduchej prevádzky, rýchlej a pohodlnej, vysokej citlivosti, dobrej opakovateľnosti a nízkej miery kontaminácie, je široko používaná v lekárskom testovaní, hodnotení účinnosti liekov, výskume génovej expresie, transgénnom výskume, detekcii génov, detekcii patogénov, detekcii zvierat a rastlín., testovanie potravín a iné oblasti.
Či už sa teda venujete základnému výskumu v biologických vedách, alebo zamestnancom farmaceutických spoločností, chovateľských spoločností, potravinárskych spoločností, alebo aj pracovníkom vstupno-výstupných inšpekčných a karanténnych úradov, oddelení monitorovania životného prostredia, nemocníc a iných útvarov, budete viac či menej vystavení Alebo potrebujete poznať znalosti z ovládania kvantitatívnej PCR.

Princíp real Time PCR

Real Time PCR je metóda, pri ktorej sa do reakčného systému PCR pridávajú fluorescenčné látky a intenzita fluorescenčného signálu v procese PCR reakcie sa v reálnom čase monitoruje pomocou kvantitatívneho PCR prístroja a nakoniec sa analyzujú a spracujú experimentálne dáta.

【Amplifikačná krivka】je krivka opisujúca dynamický proces PCR.Amplifikačná krivka PCR v skutočnosti nie je štandardná exponenciálna krivka, ale sigmoidná krivka.

[Plošinová fáza amplifikačnej krivky]So zvýšením počtu cyklov PCR, inaktiváciou DNA polymerázy, vyčerpaním dNTP a primerov a inhibíciou syntéznej reakcie pyrofosfátom ako vedľajším produktom reakcie atď. sa PCR nie vždy rozširuje exponenciálne.a nakoniec vstúpi na náhornú plošinu.

[Krivka exponenciálneho rastu oblasti amplifikácie]Hoci sa fáza plató značne líši, v určitej oblasti oblasti exponenciálneho rastu amplifikačnej krivky je opakovateľnosť veľmi dobrá, čo je veľmi dôležité pre kvantitatívnu analýzu PCR.

[Hodnota prahu a hodnota Ct]Limitnú hodnotu detekcie fluorescencie sme nastavili na príslušnú pozíciu v oblasti exponenciálneho rastu amplifikačnej krivky, a to prahovú hodnotu (Threshold).Priesečníkom prahovej hodnoty a amplifikačnej krivky je hodnota Ct, to znamená, že hodnota Ct sa vzťahuje na počet cyklov (Threshold Cycle), keď sa dosiahne prahová hodnota.

Nižšie uvedený graf jasne ukazuje vzťah medzi prahovou čiarou a krivkou amplifikácie, prahom a hodnotou Ct.

【Ako kvantifikovať?】

Matematickou teóriou bolo dokázané, že hodnota Ct má inverzný lineárny vzťah s logaritmom počtu počiatočných šablón.Real Time PCR monitoruje produkty PCR amplifikácie v reálnom čase a kvantifikuje ich počas fázy exponenciálnej amplifikácie.

Pre každý cyklus PCR sa DNA exponenciálne zvýšila 2-krát a čoskoro dosiahla plató.

Za predpokladu, že množstvo východiskovej DNA je A₀ po n cykloch možno teoretické množstvo produktu DNA vyjadriť ako:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Potom, čím vyššie je počiatočné množstvo DNA Ao, tým skôr množstvo amplifikovaného produktu dosiahne detekčnú hodnotu An a počet cyklov pri dosiahnutí An je hodnota Ct.To znamená, že čím vyššie je počiatočné množstvo DNA Ao, tým skôr vrcholí amplifikačná krivka a zodpovedajúcim spôsobom je požadovaný počet cyklov n menší.

Uskutočňujeme gradientové riedenie štandardu známej koncentrácie a používame ho ako templát pre Real Time PCR a získame sériu amplifikačných kriviek v rovnakých intervaloch v poradí počiatočného množstva DNA od viac po menej.Podľa lineárneho vzťahu medzi hodnotou Ct a logaritmom počtu štartovacích šablón a[štandardná krivka] môže byť vytvorená.

Nahradením hodnoty Ct vzorky s neznámou koncentráciou do štandardnej krivky je možné získať počiatočné templátové množstvo vzorky s neznámou koncentráciou, čo je kvantitatívny princíp Real Time PCR.

Detekčná metóda Real Time PCR

Real Time PCR deteguje produkty PCR amplifikácie detekciou intenzity fluorescencie v reakčnom systéme.

Princíp metódy zalievania fluorescenčného farbiva】

Fluorescenčné farbiváTB Green®, sa môže nešpecificky viazať na dvojvláknovú DNA v systémoch PCR a po naviazaní fluoreskovať.

Intenzita fluorescencie v reakčnom systéme vzrástla exponenciálne s nárastom cyklov PCR.Detegovaním intenzity fluorescencie možno v reálnom čase monitorovať množstvo amplifikácie DNA v reakčnom systéme a následne spätne odhadnúť množstvo východiskového templátu vo vzorke.

【Princíp metódy fluorescenčnej sondy】

fluorescenčná sondaje sekvencia nukleovej kyseliny s fluorescenčnou skupinou na 5' konci a zhášacou skupinou na 3' konci, ktorá sa môže špecificky viazať na templát.Keď je sonda neporušená, fluorescencia emitovaná fluorofórom je zhášaná zhášacou skupinou a nemôže fluoreskovať.Keď sa sonda rozloží, fluorescenčná látka disociuje a emituje fluorescenciu.

Do reakčného roztoku PCR sa pridá fluorescenčná sonda.Počas procesu žíhania sa fluorescenčná sonda naviaže na špecifickú polohu templátu.Počas procesu predlžovania môže 5′→3′ exonukleázová aktivita enzýmu PCR rozložiť fluorescenčnú sondu hybridizovanú s templátom a fluorescenčná látka je disociovaná, aby emitovala fluorescenciu.Detegovaním intenzity fluorescencie sondy v reakčnom systéme možno dosiahnuť účel monitorovania množstva amplifikácie produktu PCR.

【Výber metódy fluorescenčnej detekcie】

Ak sa používa na rozlíšenie sekvencií s vysokou homológiou a na vykonávanie multiplexnej PCR detekcie, ako je analýza typizácie SNP, metóda fluorescenčnej sondy je nenahraditeľná.
Pre ďalšie experimenty PCR v reálnom čase možno použiť jednoduchú, nenáročnú a lacnú metódu fluorescenčnej chiméry.

sond Silná špecificita, schopná multiplexnej PCR

Nedostatok

Vysoké požiadavky na špecifickosť pre amplifikáciu;

multiplexnú PCR nemožno vykonaťPotreba navrhnúť špecifické sondy, vysoká cena;

niekedy je návrh sondy náročný

Súvisiace produkty: