RNáza je citlivé slovo, ktoré mnohí študenti, ktorí často robia experimenty s extrakciou RNA, nechcú počuť.Plne vyzbrojená RNA, ktorá bola nakoniec extrahovaná vysoko toxickými činidlami fenolom a chloroformom, bola degradovaná.Nie som zmierený!!!Dnes sa pozrieme na pôvod slávneho Rnase.

Ribonukleáza (RNáza) alebo RNáza je nukleáza, ktorá dokáže hydrolyzovať RNA na malé molekuly.RNáza, ako proteín s malou molekulou, je nezvyčajne stabilná .Konvenčná vysokoteplotná a vysokotlaková parná sterilizácia a proteínové inhibítory ho nedokážu úplne inaktivovať.Stabilita RNázy pochádza hlavne z disulfidových väzieb v štruktúre.Napríklad bežne používaná RNáza hovädzieho pankreasu má len 124 aminokyselín, ale obsahuje 4 disulfidové väzby.Sírna väzba a disulfidová väzba dodávajú RNáze vynikajúcu tepelnú stabilitu.Okrem toho má rnáza relatívne malú molekulovú hmotnosť a v mnohých prípadoch môže rýchlo obnoviť svoju pôvodnú konformáciu.

Okrem toho, že je mimoriadne stabilný,RNázy sú v laboratóriu všadeprítomné .RNáza je biologický obranný mechanizmus.Pre bunku je exogénna RNA často smrteľná.V porovnaní s exogénnou DNA je exogénna RNA často nebezpečnejšia.RNA sa šťastne prepisuje a prekladá, takže takmer všetky organizmy si vyvinuli RNázy na obranu proti invázii exogénnej RNA.Preto bakteriálne bunky kultivované v laboratóriu a vy, ktorí extrahujete RNA, vyžarujú arómu RNázy.Ľudské telesné tekutiny (sliny, slzy atď.) obsahujú veľké množstvo RNázy, takže pri degradácii RNA neplačte.Čím viac plačete, tým horšie je degradácia RNA!!Sestra Daiyu nie je vhodná na extrakciu RNA!

Okrem toho vaša jemná pokožka obsahuje aj veľa RNázy a značkovače, pipety, dvere chladničky a kľučky dverí, ktorých sa pokožka dotkla, tiež obsahujú RNázu.

S toľkým táraním sa poďme pozrieť na to, ako sa vysporiadať s RNázami.

Prvá vec, ktorá každému napadne pri odstraňovaní RNA, jeDEPC(dietylpyrokarbonát).DEPC hlavne denaturuje proteín spojením s imidazolovým kruhom aktívnej skupiny RNázy histidínu, čím inhibuje aktivitu enzýmu.0,1% DEPC môže mať lepší účinok na odstránenie Rnase, ale musíme venovať pozornosť tomu, že DEPC je známy karcinogén, takže pri jeho používaní je potrebné venovať osobitnú pozornosť.

Pre RNázu musíme začať z dvoch aspektov,prvým je inhibícia aktivity endogénnej RNázy

Konvenčné činidlá na extrakciu RNA, ako je guanidín izotiokyanát a DTT obsiahnuté v Trizole, môžu otvoriť disulfidovú väzbu RNázy, ale stále existujú určité RNázy, najmä vo vzorkách tkanív, takže dávajte pozor na nízku teplotu.

1.Vzorku tkaniva po vybratí ihneď ponorte do tekutého dusíka alebo do komerčného roztoku na konzerváciu RNA.

2.Po extrakcii RNA bunkovej vzorky ju pridajte do lyzačného roztoku a lýzujte ju na ľadovom boxe

3. Na brúsenie je najlepšie použiť tekutý dusík keď sú vzorky tkaniva homogenizované.Pri použití elektrického homogenizátora bez tekutého dusíka dbajte na úplné predchladenie adaptéra homogenátu.

Druhým je exogénna DNáza

1.Buďte plne vyzbrojení, noste laboratórny plášť, noste masku a určite si nasaďte pár nových rukavíc (nebuďte takí šetrní!! Treba poznamenať, že Trizol je super žieravý a je veľmi silný aj cez rukavice, takže vám nekvapká na ruky).

2.Všetky použité pipetové špičky, EP skúmavky, PCR skúmavky a ďalšie vybavenie musia byť ošetrené de-RNázou.Môže byť namočený v 0,1% DEPC a potom natlakovaný pod vysokým tlakom.Venujte pozornosť prevádzke v digestore.Miestni tyrani môžu priamo nakupovať spotrebný materiál na odstraňovanie enzýmov.

PS: Poviem vám lenivú metódu.Vysoká teplota a vysoký tlak síce nedokážu úplne odstrániť RNázu, odstránia však veľkú časť z nej.2 krát vysoká teplota a vysoký tlak má dobrý účinok a extrakcia RNA má malý účinok.

3.Alkohol môže denaturovať bielkoviny,takže tabuľka extrakcie RNA sa môže utrieť 75% alkoholom a rukavice je možné nastriekať aj alkoholom.

4.Konečný roztok rozpúšťajúci RNA a centrifugačná skúmavka by mali byť tiež ošetrené de-RNázou.DEPC voda je bežne používaný roztok na rozpúšťanie RNA.Poďme sa porozprávať o správnom spôsobe prípravy DEPC vody (pri kúpe nezabudnite prebaliť komerčnú DEPC)

Pridajte DEPC do ultračistej vody v pomere 1:1000, dobre pretrepte, nechajte stáť cez noc pri 37 °C a sterilizujte pri 121 °C pri vysokej teplote a vysokom tlaku 15 minút.DEPC vodu možno skladovať pri -20 °C v 1 ml alikvótoch.

Nakoniec, aby som to zhrnul: nízka teplota je kľúčom, so spotrebným materiálom sa dobre manipuluje, plne vyzbrojený a menej hovorov!

No a to je pre dnešnú stratégiu všetko.Prajem vám všetku koncentráciu a čistotu RNA, ktorú ste spomenuli.Oba A260/A280 sú 2.0!!!

Samozrejme, ak použijete aSúprava na extrakciu RNA na prevádzku pri izbovej teplote, možno sa s vyššie uvedenými problémami nestretnete.

Prevádzka pri izbovej teplote, bez pridania DNázy, extrahuje celkovú RNA z buniek za 11 minút a extrahuje celkovú RNA zo živočíšnych tkanív alebo rastlín za 30 minút.

Pre skúšobné vzorky kontaktujte:overseas@foregene.com

Súvisiace produkty:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/