• PCR je metóda používaná na amplifikáciu DNA z malého množstva templátu DNA.RT-PCR využíva reverznú transkripciu na produkciu templátu DNA zo zdroja RNA, ktorý sa potom môže amplifikovať.
• PCR a RT-PCR sú typicky koncové reakcie, zatiaľ čo qPCR a RT-qPCR používajú kinetiku rýchlosti syntézy produktu počas PCR reakcie na kvantifikáciu množstva prítomného templátu.
• Novšie metódy, ako je digitálna PCR, poskytujú absolútnu kvantifikáciu počiatočného templátu DNA, zatiaľ čo metódy ako izotermická PCR znižujú potrebu drahého vybavenia na poskytovanie spoľahlivých výsledkov.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je relatívne jednoduchá a široko používaná technika molekulárnej biológie na amplifikáciu a detekciu sekvencií DNA a RNA.V porovnaní s tradičnými metódami klonovania a amplifikácie DNA, ktoré môžu často trvať niekoľko dní, vyžaduje PCR len niekoľko hodín.PCR je vysoko citlivá a vyžaduje minimálny templát na detekciu a amplifikáciu špecifických sekvencií.Základné metódy PCR ďalej pokročili od jednoduchej detekcie DNA a RNA.Nižšie uvádzame prehľad rôznych metód PCR a činidiel, ktoré poskytujeme v Enzo Life Sciences pre vaše výskumné potreby.Naším cieľom je pomôcť vedcom rýchlo získať prístup k činidlám PCR, ktoré môžu použiť v ďalšom výskumnom projekte!

PCR

Na štandardnú PCR potrebujete len DNA polymerázu, horčík, nukleotidy, priméry, templát DNA, ktorý sa má amplifikovať, a termocykler.Mechanizmus PCR je taký jednoduchý ako jeho účel: 1) dvojvláknová DNA (dsDNA) sa tepelne denaturuje, 2) priméry sa pripájajú k jednotlivým vláknam DNA a 3) priméry sa predlžujú DNA polymerázou, výsledkom čoho sú dve kópie pôvodné vlákno DNA.Proces denaturácie, žíhania a predlžovania počas série teplôt a časov je známy ako jeden cyklus amplifikácie (obr. 1).

Každý krok cyklu by mal byť optimalizovaný pre použitú šablónu a sadu primerov.Tento cyklus sa opakuje približne 20 až 40-krát a amplifikovaný produkt sa potom môže analyzovať, typicky pomocou agarózového gélu (obr. 2).

Keďže PCR je vysoko citlivá metóda a na jednotlivé reakcie sú potrebné veľmi malé objemy, odporúča sa pripraviť základnú zmes pre niekoľko reakcií.Hlavná zmes sa musí dobre premiešať a potom rozdeliť podľa počtu reakcií, čím sa zabezpečí, že každá reakcia bude obsahovať rovnaké množstvo enzýmu, dNTP a primerov.Mnoho dodávateľov, ako napríklad Enzo Life Sciences, ponúka aj zmesi PCR, ktoré už obsahujú všetko okrem primerov a šablóny DNA.

Oblasti bohaté na guanín/cytozín (bohaté na GC) predstavujú výzvu v štandardných technikách PCR.Sekvencie bohaté na GC sú stabilnejšie ako sekvencie s nižším obsahom GC.Okrem toho sekvencie bohaté na GC majú tendenciu vytvárať sekundárne štruktúry, ako sú napríklad vlásenkové slučky.V dôsledku toho je ťažké úplne oddeliť dvojité vlákna bohaté na GC počas denaturačnej fázy.V dôsledku toho DNA polymeráza nemôže syntetizovať nové vlákno bez prekážok.Vyššia denaturačná teplota to môže zlepšiť a úpravy smerom k vyššej teplote žíhania a kratšiemu času žíhania môžu zabrániť nešpecifickej väzbe primerov bohatých na GC.Ďalšie činidlá môžu zvýšiť amplifikáciu sekvencií bohatých na GC.DMSO, glycerol a betaín pomáhajú narušiť sekundárne štruktúry, ktoré sú spôsobené interakciami GC, a tým uľahčujú separáciu dvojitých vlákien.

Hot Start PCR

Nešpecifická amplifikácia je problém, ktorý sa môže vyskytnúť počas PCR.Väčšina DNA polymeráz, ktoré sa používajú na PCR, funguje najlepšie pri teplotách okolo 68 °C až 72 °C.Enzým však môže byť aktívny aj pri nižších teplotách, aj keď v menšom stupni.Pri teplotách hlboko pod teplotou žíhania sa môžu priméry viazať nešpecificky a viesť k nešpecifickej amplifikácii, aj keď je reakcia nastavená na ľade.Tomu sa dá zabrániť použitím inhibítorov polymerázy, ktoré sa disociujú z DNA polymerázy až po dosiahnutí určitej teploty, preto sa používa termín hot start PCR.Inhibítorom môže byť protilátka, ktorá viaže polymerázu a denaturuje pri počiatočnej denaturačnej teplote (typicky 95 °C).

High Fidelity Polymerase

Zatiaľ čo DNA polymerázy amplifikujú pomerne presne na pôvodnú templátovú sekvenciu, môžu sa vyskytnúť chyby pri porovnávaní nukleotidov.Nesúlad v aplikáciách, ako je klonovanie, môže viesť k skráteným transkriptom a nesprávne preloženým alebo neaktívnym proteínom po prúde.Aby sa predišlo týmto nesúladom, boli identifikované a začlenené do pracovného postupu polymerázy s „korektúrou“.Prvá korekčná polymeráza, Pfu, bola identifikovaná v roku 1991 v Pyrococcus furiosus.Tento enzým Pfu má 3' až 5' exonukleázovú aktivitu.Keď sa DNA amplifikuje, exonukleáza odstraňuje nesprávne spárované nukleotidy na 3' konci vlákna.Potom sa nahradí správny nukleotid a syntéza DNA pokračuje.Identifikácia nesprávnych nukleotidových sekvencií je založená na väzbovej afinite k správnemu nukleozidtrifosfátu s enzýmom, kde neefektívna väzba spomaľuje syntézu a umožňuje správnu náhradu.Korektorská aktivita Pfu polymerázy má za následok menej chýb v konečnej sekvencii v porovnaní s Taq DNA polymerázou.V posledných rokoch boli identifikované ďalšie korekčné enzýmy a boli vykonané modifikácie pôvodného enzýmu Pfu, aby sa ďalej znížila chybovosť počas amplifikácie DNA.

RT-PCR

Reverzná transkripčná PCR alebo RT-PCR umožňuje použitie RNA ako templátu.Ďalší krok umožňuje detekciu a amplifikáciu RNA.RNA sa reverzne transkribuje do komplementárnej DNA (cDNA) pomocou reverznej transkriptázy.Kvalita a čistota templátu RNA sú nevyhnutné pre úspech RT-PCR.Prvým krokom RT-PCR je syntéza hybridu DNA/RNA.Reverzná transkriptáza má tiež funkciu RNázy H, ktorá degraduje RNA časť hybridu.Jednovláknová molekula DNA je potom dokončená DNA-dependentnou DNA polymerázovou aktivitou reverznej transkriptázy na cDNA.Účinnosť reakcie prvého vlákna môže ovplyvniť proces amplifikácie.Odteraz sa na amplifikáciu cDNA používa štandardný postup PCR.Možnosť revertovať RNA na cDNA pomocou RT-PCR má mnoho výhod a primárne sa používa na analýzu génovej expresie.RNA je jednovláknová a veľmi nestabilná, čo sťažuje prácu s ňou.Bežne slúži ako prvý krok v qPCR, ktorý kvantifikuje RNA transkripty v biologickej vzorke.

qPCR a RT-qPCR

Kvantitatívna PCR (qPCR) sa používa na detekciu, charakterizáciu a kvantifikáciu nukleových kyselín pre mnohé aplikácie.V RT-qPCR sa transkripty RNA často kvantifikujú najskôr reverznou transkripciou do cDNA, ako je opísané vyššie, a potom sa následne vykoná qPCR.Rovnako ako v štandardnej PCR sa DNA amplifikuje tromi opakujúcimi sa krokmi: denaturáciou, žíhaním a predĺžením.V qPCR však fluorescenčné značenie umožňuje zhromažďovanie údajov počas postupu PCR.Táto technika má mnoho výhod vďaka množstvu dostupných metód a chemických látok.

V qPCR na báze farbiva (zvyčajne zelená) umožňuje fluorescenčné značenie kvantifikáciu amplifikovaných molekúl DNA pomocou použitia farbiva viažuceho dsDNA.Počas každého cyklu sa meria fluorescencia.Fluorescenčný signál sa zvyšuje úmerne množstvu replikovanej DNA.DNA je teda kvantifikovaná v „reálnom čase“ (obr. 3).Nevýhody qPCR na báze farbiva spočívajú v tom, že naraz možno skúmať iba jeden cieľ a že farbivo sa bude viazať na akúkoľvek ds-DNA prítomnú vo vzorke.

V qPCR založenom na sonde možno v každej vzorke súčasne detegovať veľa cieľov, čo si však vyžaduje optimalizáciu a návrh sondy (sond) špecifickej pre cieľ, ktorá sa používa okrem primérov.K dispozícii je niekoľko typov vzorov sond, ale najbežnejším typom je hydrolyzačná sonda, ktorá obsahuje fluorofór a zhášač.Fluorescenčný rezonančný prenos energie (FRET) zabraňuje emisii fluorofóru cez zhášač, kým je sonda neporušená.Avšak počas PCR reakcie je sonda hydrolyzovaná počas predlžovania priméru a amplifikácie špecifickej sekvencie, na ktorú je naviazaná.Štiepenie sondy oddeľuje fluorofór od zhášača a vedie k zvýšeniu fluorescencie závislému od amplifikácie (obr. 4).Fluorescenčný signál z reakcie qPCR založenej na sonde je teda úmerný množstvu cieľovej sekvencie sondy prítomnej vo vzorke.Pretože qPCR na báze sondy je špecifickejšia ako qPCR na báze farbiva, je to často technológia používaná v diagnostických testoch na báze qPCR.

Izotermické zosilnenie

Vyššie uvedené techniky PCR vyžadujú drahé termocyklovacie zariadenie na presné zvyšovanie a znižovanie teplôt v komore pre kroky denaturácie, žíhania a predlžovania.Bolo vyvinutých množstvo techník, ktoré nepotrebujú také presné zariadenia a môžu sa vykonávať v jednoduchom vodnom kúpeli alebo dokonca v bunkách záujmu.Tieto techniky sa súhrnne nazývajú izotermická amplifikácia a pracujú na báze exponenciálneho, lineárneho alebo kaskádového zosilnenia.

Najznámejším typom izotermickej amplifikácie je slučkou sprostredkovaná izotermická amplifikácia alebo LAMP.LAMP využíva exponenciálnu amplifikáciu pri 65 °C na amplifikáciu templátovej DNA alebo RNA.Pri vykonávaní LAMP sa na syntézu novej DNA používa štyri až šesť primérov komplementárnych k oblastiam cieľovej DNA s DNA polymerázou.Dva z týchto primérov majú komplementárne sekvencie, ktoré rozpoznávajú sekvencie v iných priméroch a viažu ich, čo umožňuje vytvorenie štruktúry „slučky“ v novo syntetizovanej DNA, ktorá potom napomáha anelácii primérov v nasledujúcich kolách amplifikácie.LAMP možno vizualizovať viacerými metódami, vrátane fluorescencie, elektroforézy na agarózovom géli alebo kolorimetrie.Jednoduchosť vizualizácie a detekcie prítomnosti alebo neprítomnosti produktu kolorimetriou a nedostatok potrebného drahého vybavenia urobili z LAMP vhodnú možnosť na testovanie SARS-CoV-2 v oblastiach, kde klinické laboratórne testovanie nebolo ľahko dostupné, alebo na skladovanie a prepravu vzoriek. nebolo možné, alebo v laboratóriách, ktoré predtým nemali zariadenie na termocyklovanie PCR.