Ⅰ. Zvýšte citlivosť reakčného systému:

1. Oddeľte vysokokvalitnú RNA:

Úspešná syntéza cDNA pochádza z vysoko kvalitnej RNA.Kvalitná RNA by mala zabezpečiť aspoň celkovo dlhšie a neobsahuje inhibítory, ktoré neobsahujú záznamové enzýmy, ako je EDTA alebo SDS.Kvalita RNA určuje maximálnu hodnotu sekvenčnej informácie, ktorú môžete prepísať do cDNA.Všeobecná metóda purifikácie RNA je kroková metóda s použitím izookyanátu/acidofenolu.Aby sa zabránilo znečisteniu RNázy, RNA oddelená od vzorky bohatej na RNázu (ako je pankreas) vyžaduje skladovanie formaldehydu, aby sa ušetrila vysokokvalitná RNA, čo platí ešte viac pre dlhodobé skladovanie.RNA extrahovaná z pečene potkana bola v podstate degradovaná po jednom týždni skladovania vo vode, zatiaľ čo RNA extrahovaná zo sleziny potkana zostala stabilná po troch rokoch skladovania vo vode.Okrem toho transkripty väčšie ako 4 kb sú citlivejšie na degradáciu stopovej RNázy ako malé transkripty.Aby sa zvýšila stabilita uchovávacej vzorky RNA, RNA môže byť rozpustená v methalamínovom ióne a skladovaná pri teplote -70 °C.Thylid používaný na záchranu RNA nesmie obsahovať rôzne predmety, ktoré degradujú RNA.RNA, ktorá pochádza z pankreasu, môže byť uložená v metalmamíne najmenej jeden rok.Keď ste pripravení použiť RNA, môžete použiť nasledujúce metódy na vyzrážanie RNA: pridajte NaCl do 0,2 m a 4-násobku objemu etanolu, nechajte 3-5 minút pri izbovej teplote a 10 000 × g odstreďte na 5 minút.

2. Použite reverznú transkriptázu bez aktivity RNázyH (RNázaH-):

Inhibítory RNázy sa často pridávajú na reverzné transkripčné reakcie, aby sa zvýšila dĺžka a výťažok syntézy cDNA.Inhibítor RNázy sa pridáva v prvej reakcii reťazovej syntézy v prítomnosti pufrov a redukčných činidiel, ako je DTT, pretože proces pre-cDNA syntézy denaturuje inhibítor, čím sa uvoľnia naviazané RNázy, ktoré degradujú RNA.Inhibítor proteínovej RNázy bráni iba degradácii RNA RNázou A, B, C a nezabraňuje RNázam na koži, preto je potrebné dávať pozor, aby sa napriek použitiu týchto inhibítorov nezaviedli RNázy z prstov.

Reverzná transkriptáza katalyzuje konverziu RNA na cDNA.M-MLV aj AMV majú okrem svojej vlastnej polymerázovej aktivity aj endogénnu aktivitu RNázyH.Aktivita RNázyH súťaží s polymerázovou aktivitou o heterozygotné vlákna vytvorené medzi RNA templátmi a DNA primermi alebo cDNA predlžovacími vláknami a degraduje RNA:RNA vlákna v komplexoch DNA.Templáty RNA degradované aktivitou RNázyH sa už nemôžu používať ako účinné substráty pre syntézu cDNA, čím sa znižuje výťažok a dĺžka syntézy cDNA.Takže eliminácia alebo výrazné zníženie aktivity RNázyH reverznej transkriptázy by bolo veľkým prínosom.

SuperScriptⅡ reverzná transkriptáza, MMLV reverzná transkriptáza RNaseH- a termoScript reverzná transkriptáza, AMV RNaseH- poskytli viac cDNA plnej dĺžky ako MMLV a AMV.Citlivosť RT-PCR je ovplyvnená množstvom syntetizovanej cDNA.ThermoScript je oveľa citlivejší ako AMV.Veľkosť produktov RT-PCR je obmedzená schopnosťou reverznej transkriptázy syntetizovať cDNA, najmä pri klonovaní väčších Cdna.V porovnaní s MMLV, SuperScripⅡ výrazne zvýšil výťažok dlhých produktov RT-PCR.Reverzná transkriptáza RNaseH- tiež zvyšuje tepelnú stabilitu, takže reakcia sa môže uskutočňovať pri teplotách vyšších ako normálne, 37-42 °C.Za navrhovaných podmienok syntézy sa použili oligo(dT) priméry a 10 uCi [alfa-p]dCTP.Celková produkcia prvého reťazca bola vypočítaná pomocou TCA precipitačnej metódy.Kompletná cDNA sa analyzovala s použitím odstraňovania pásikov triedených podľa veľkosti a počítania v alkalickom agarózovom géli.

3. Zvýšte teplotu uchovania tepla reverznej transkripcie：

Vyššia udržiavacia teplota pomáha otvoriť sekundárnu štruktúru RNA a zvýšiť výťažok reakcie.Pre väčšinu RNA templátov, udržiavanie RNA a primeru pri 65 °C bez pufra alebo soli a ich rýchle ochladenie na ľade eliminuje väčšinu sekundárnych štruktúr a umožňuje primérom naviazať sa.Niektoré šablóny však stále majú sekundárnu štruktúru, dokonca aj po tepelnej denaturácii.Amplifikácia týchto zložitých templátov sa môže uskutočniť pomocou ThermoScript reverznej transkriptázy a umiestnením reakcie reverznej transkriptázy pri vyšších teplotách na zlepšenie amplifikácie.Vyššie udržiavacie teploty môžu tiež zvýšiť špecificitu, najmä ak sa syntéza cDNA uskutočňuje pomocou génovo špecifických primérov (GSPS) (pozri kapitolu 3).Ak používate GSP, uistite sa, že hodnota Tm základného náteru je rovnaká ako očakávaná udržiavacia teplota.Nepoužívajte oligo(dT) a náhodné priméry nad 60 °C.Náhodné priméry sa musia udržiavať pri 25 °C počas 10 minút a potom sa zvýši na 60 °C.Okrem použitia vyšších teplôt reverznej transkripcie sa špecifickosť môže zlepšiť priamym prenosom zmesi RNA/primer z denaturačnej teploty 65 °C na udržiavaciu teplotu reverznej transkripcie a pridaním predhriatej 2× reakčnej zmesi (syntéza tepelnej iniciácie cDNA).Tento prístup pomáha predchádzať párovaniu medzimolekulových báz, ku ktorému dochádza pri nižších teplotách.Použitie nástroja PCR zjednodušuje mnohé teplotné spínače potrebné pre RT-PCR.

Tepelne stabilizovaná polymeráza pôsobí ako DNA polymeráza v prítomnosti Mg2+ a RNA polymeráza v prítomnosti Mn2+.Dokáže udržať teplo až do 65 ℃.Prítomnosť Mn2+ počas PCR však znižuje presnosť, čo robí Tth polymerázu menej vhodnou na vysoko presnú amplifikáciu, ako je klonovanie cDNA.Okrem toho je Tth menej účinný pri reverznej transkripcii, čo znižuje citlivosť, a keďže jeden enzým môže vykonávať reverznú transkripciu a PCR, kontrolné reakcie bez reverznej transkripcie nemožno použiť na rozlíšenie amplifikovaných produktov cDNA od produktov kontaminovanej genómovej DNA.

4. Prísada, ktorá podporuje reverznú transkripciu:

Pridanie aditív, vrátane glycerínu a DMSO, do prvej reakcie reťazovej syntézy môže znížiť stabilitu dvojvlákna nukleovej kyseliny a uvoľniť sekundárnu štruktúru RNA.Je možné pridať až 20 % glycerínu alebo 10 % DMSO bez ovplyvnenia aktivity SuperScriptⅡ alebo MMLV.AMV môže tiež tolerovať až 20% glycerolu bez zníženia aktivity.Aby sa maximalizovala citlivosť RT-PCR v reakcii reverznej transkripcie SuperScriptⅡ, môže sa pridať 10% glycerol a izolovať sa pri 45 °C.Ak sa do PCR pridá 1/10 produktu retrotranskripčnej reakcie, koncentrácia glycerolu v amplifikačnej reakcii je 0,4 %, čo nestačí na inhibíciu PCR.

5. Spracovanie RNaseH:

Citlivosť možno zlepšiť ošetrením reakcií syntézy cDNA s RNázouH pred PCR.Pre niektoré templáty sa predpokladá, že RNA v reakcii syntézy cDNA bráni väzbe amplifikovaných produktov, v takom prípade môže ošetrenie RNázouH zvýšiť citlivosť.Vo všeobecnosti je liečba RNázouH potrebná na amplifikáciu relatívne dlhého cieľového templátu cDNA s plnou dĺžkou, ako je tuberózna scherózaⅡ s nízkou kópiou.Pre tento náročný templát RNaseH zosilnila signál generovaný cDNA syntetizovanou pomocou SuperScriptⅡ alebo AMV.Pre väčšinu reakcií RT-PCR je ošetrenie RNázouH voliteľné, pretože krok denaturácie PCR izolovanej pri teplote 95 °C typicky hydrolyzuje RNA z komplexu RNA:DNA.

6. Vylepšené metódy na detekciu malých množstiev RNA：

RT-PCR je obzvlášť náročná, keď sú dostupné len malé množstvá RNA.Pridanie glykogénu ako nosiča počas separácie RNA pomáha zvýšiť výťažok malých vzoriek.Súčasne s Trizolom možno pridať glykogén bez RNázy.Glykogén je rozpustný vo vode a môže zostať vo vodnej fáze s RNA, aby napomáhal následnému zrážaniu.Odporúčaná koncentrácia glykogénu bez RNázy je 250 μg/ml pre vzorky menšie ako 50 mg tkaniva alebo 106 kultivovaných buniek.

Pridanie acetylovaného BSA na reverzné transkripčné reakcie pomocou SuperScriptⅡ môže zvýšiť citlivosť a pre malé množstvá RNA zníženie množstva SuperScriptⅡ a pridanie 40 jednotiek inhibítora nukleázy RnaseOut môže zlepšiť úroveň detekcie.Ak sa pri separácii RNA používa glykogén, stále sa odporúča pridanie inhibítorov BSA alebo RNázy na zvrátenie transkripčných reakcií pomocou SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Zvýšte špecifickosť RT-PCR

1. Syntéza cNDA:

Na spustenie syntézy prvého vlákna cDNA možno použiť tri rôzne metódy a relatívna špecifickosť každej metódy ovplyvňuje množstvo a typ syntetizovanej cDNA.

Metóda náhodného priméru je najmenej špecifická z troch metód.Priméry sa anelujú na viacerých miestach v rámci transkriptu, aby sa vytvorila krátka cDNA s čiastočnou dĺžkou.Táto metóda sa často používa na získanie 5' koncových sekvencií a cDNA z RNA templátov so sekundárnymi štruktúrnymi oblasťami alebo s koncovými miestami, ktoré sa reverzná transkriptáza nemôže replikovať.Na získanie najdlhšej cDNA je potrebné empiricky určiť pomer primérov k RNA v každej vzorke RNA.Počiatočná koncentrácia náhodných primerov sa pohybuje od 50 do 250 ng na 20 μl reakčného systému.Pretože cDNA syntetizovaná z celkovej RNA pomocou náhodných primérov je hlavne ribozomálna RNA, poly(A)+RNA sa vo všeobecnosti vyberie ako templát.

Iniciácia oligo(dT) je špecifickejšia ako náhodné priméry.Hybridizuje sa s poly(A) chvostom, ktorý sa nachádza na 3' konci mRNA vo väčšine eukaryotických buniek.Pretože poly(A)+RNA tvorí približne 1 % až 2 % celkovej RNA, množstvo a komplexnosť cDNA je oveľa menšia, ako keby sa použili náhodné priméry.Kvôli svojej vysokej špecificite oligo(dT) vo všeobecnosti nevyžaduje optimalizáciu pomeru RNA k primeru a poly(A)+ selekciu.Odporúča sa použiť 0,5 μg oligo(dT) na 20 μl reakčného systému.oligo(dT)12-18 je vhodný pre väčšinu RT-PCR.Systém ThermoScript RT-PCR poskytuje oligo(dT)20 vďaka svojej dobrej tepelnej stabilite a je vhodný pre vyššie udržiavacie teploty.

Génovo špecifické priméry (GSP) sú najlepšie špecifické priméry pre krok reverznej transkripcie.GSP je antisense oligonukleozid, ktorý môže špecificky hybridizovať s cieľovými sekvenciami RNA, namiesto toho, aby aneloval všetky Rnas, ako sú náhodné priméry alebo oligo(dT).Pravidlá používané na návrh PCR primérov platia aj pre návrh reakcie reverznej transkripcie GSP.GSP môže byť rovnaká sekvencia ako amplifikačný primér anelovaný na konci mRNA3', alebo môže byť GSP navrhnutý tak, aby bol anelovaný po smere s reverzným amplifikačným primérom.Pre niektoré amplifikované objekty je potrebné navrhnúť viac ako jeden antisense primér pre úspešnú RT-PCR, pretože sekundárna štruktúra cieľovej RNA môže brániť priméru vo väzbe.Odporúča sa použiť 1 pmol antisense GSP v prvom reakčnom systéme reťazovej syntézy s objemom 20 μl.

2. Zvýšte teplotu uchovania tepla reverznej transkripcie：

Aby sa plne využili výhody GSP špecificity, mala by sa použiť reverzná transkriptáza s vysokou tepelnou stabilitou.Tepelne stabilná reverzná transkriptáza môže byť izolovaná pri vyšších teplotách, aby sa zvýšila tvrdosť reakcie.Napríklad, ak je GSP anelovaný pri 55 °C, potom špecificita GSP nie je plne využitá, ak sa reverzná transkripcia uskutočňuje pri 37 °C s nízkou presnosťou s použitím AMV alebo M-MLV.Avšak SuperScripⅡ a ThermoScript môžu reagovať pri 50 °C alebo vyššej, čo eliminuje nešpecifické produkty vyrábané pri nižších teplotách.Pre maximálnu špecifickosť sa zmes RNA/primer môže preniesť priamo z denaturačnej teploty 65 °C na teplotu udržiavania reverznej transkripcie pridaním predhriatej 2 x reakčnej zmesi (tepelná iniciácia syntézy cDNA).To pomáha predchádzať párovaniu báz medzi molekulami pri nízkych teplotách.Použitie nástroja PCR zjednodušuje mnohé teplotné prechody potrebné pre RT-PCR.

3. Znížte kontamináciu genómovou DNA：

Jednou z možných ťažkostí pri RT-PCR je to, že RNA kontaminuje genómovú DNA.Použitie lepších metód separácie RNA, ako je Trizol Reagent, znižuje kontamináciu genómovej DNA v prípravkoch RNA.Aby sa predišlo produktom produkovaným z genómovej DNA, RNA môže byť ošetrená amplifikačnou triedou DnasⅠ, aby sa pred reverznou transkripciou odstránila kontaminovaná DNA.Vzorky sa udržiavali pri 65 °C v 2,0 mM EDTA počas 10 minút, aby sa ukončilo štiepenie DNázouⅠ.EDTA chelátuje horčíkové ióny, aby sa zabránilo hydrolýze RNA závislej od horčíkových iónov, ku ktorej dochádza pri vysokých teplotách.

Aby sa oddelila amplifikovaná cDNA od produktu amplifikácie genómovej DNA, môžu sa navrhnúť priméry, ktoré samostatne nasadajú na oddelený exón.Produkty PCR odvodené z cDNA budú kratšie ako produkty odvodené z kontaminovanej genómovej DNA.Kontrolovaný experiment bez reverznej transkripcie sa tiež uskutočňuje na každom templáte RNA, aby sa určilo, či daný fragment pochádza z genómovej DNA alebo cDNA.Produkty PCR získané v neprítomnosti reverznej transkripcie pochádzajú z genómu.

Súvisiaci produkt

Jednoduchá RT-PCR^ᵀᴹJa (Jeden krok)

-Jednokroková súprava umožňuje vykonanie reverznej transkripcie a PCR v tej istej skúmavke.Potrebuje iba pridať templátovú RNA, špecifické PCR priméry a ddH bez RNázy₂O.

- Kvantitatívna analýza RNA v reálnom čase môže byť vykonaná rýchlo a presne.

-Súprava využíva jedinečné reverzné transkripčné činidlo Foregene a DNA polymerázu Foregene HotStar Taq v kombinácii s jedinečným reakčným systémom na efektívne zlepšenie účinnosti amplifikácie a špecifickosti reakcie.

- Optimalizovaný reakčný systém spôsobuje, že reakcia má vyššiu citlivosť detekcie, silnejšiu tepelnú stabilitu a lepšiu toleranciu.

RT Easy II (s GDNázou) Master Premix pre syntézu prvého vlákna CDNA pre PCR v reálnom čase s GDNázou

-Efektívna schopnosť odstrániť gDNA, ktorá dokáže odstrániť gDNA v šablóne do 2 minút.

-Efektívny systém reverznej transkripcie, dokončenie syntézy prvého vlákna cDNA trvá len 15 minút.

-Komplexné šablóny: šablóny s vysokým obsahom GC a komplexnou sekundárnou štruktúrou môžu byť tiež obrátené s vysokou účinnosťou.

- Vysoko citlivý systém reverznej transkripcie, šablóny na úrovni pg môžu tiež získať vysokokvalitnú cDNA.

- Systém reverznej transkripcie má vysokú tepelnú stabilitu, optimálna reakčná teplota je 42 ℃ a stále má dobrý výkon reverznej transkripcie pri 50 ℃.