Prehľad
Rýchla identifikácia transgénnych rastlín
Text/Tong Yucheng
Experimentálna prevádzka/Han Ying
Redaktor/Wen Youjun
Slová/1600+
Odporúčaný čas čítania/8-10 minút
Rýchla identifikácia transgénnych rastlín
Ako nováčik v laboratóriu nie je dobrou úlohou vytriediť pozitívne rastliny zo skupiny rastlín s nízkou mierou konverzie.Po prvé, DNA sa musí extrahovať z veľkého počtu vzoriek jeden po druhom a potom sa cudzie gény detegujú pomocou PCR.Výsledkom sú však často prázdne miesta a pásy s niekoľkými položkami, ale nie je možné určiť, či ide o zmeškané alebo nesprávne zistenia..Je veľmi bezmocné čeliť takémuto experimentálnemu procesu a výsledkom?Nebojte sa, brat vás naučí, ako jednoducho a presne odstrániť transgénne pozitívne rastliny.
Krok 1: Navrhnite detekčné priméry
Určte endogénny gén a exogénny gén, ktorý sa má detegovať, podľa testovanej vzorky a vyberte reprezentatívnu 100-500 bp sekvenciu v géne pre návrh priméru.Dobré primery môžu zabezpečiť presnosť výsledkov detekcie a skrátiť čas detekcie (bežne používané detekčné primery nájdete v prílohe).
Poznámka:
Novo navrhnuté priméry musia optimalizovať reakčné podmienky a overiť presnosť, presnosť a detekčný limit detekcie pred vykonaním detekcie vo veľkom meradle.
Krok 2:Vypracujte experimentálny protokol
Pozitívna kontrola: Použite purifikovanú DNA obsahujúcu cieľový fragment ako templát na určenie, či sú reakčný systém a podmienky PCR normálne.
Negatívna/slepá kontrola: Použite šablónu DNA alebo ddH2O, ktorý neobsahuje cieľový fragment ako templát na zistenie, či v systéme PCR existuje zdroj kontaminácie.
Vnútorná referenčná kontrola: použite kombináciu primér/sonda endogénneho génu vzorky, ktorá sa má testovať, na vyhodnotenie, či možno templát detegovať pomocou PCR.
Poznámka:
Pre každý test by sa mali nastaviť pozitívne, negatívne/slepé kontroly a kontroly vnútornej kontroly, aby sa vyhodnotila platnosť experimentálnych výsledkov.
Krok 3: Príprava experimentu
Pred použitím skontrolujte, či je roztok rovnomerne premiešaný.Ak sa zistí zrazenina, je potrebné ju pred použitím rozpustiť a zmiešať podľa návodu.2×PCR zmes je potrebné pred použitím napipetovať a opakovane premiešať mikropipetou, aby sa predišlo nerovnomernej distribúcii iónov.
Poznámka:
Vytiahnite pokyny a pozorne si ich prečítajte a pred experimentom sa pripravte v prísnom súlade s pokynmi.
Krok 4: Pripravte reakčný systém PCR
Podľa experimentálneho protokolu zmiešajte priméry, H2O, 2× PCR premiešajte, odstreďte a rozdeľte do každej reakčnej skúmavky.
Poznámka:
Na rozsiahle alebo dlhodobé testovanie sa odporúča použiť reakčný systém PCR obsahujúci enzým UNG, ktorý dokáže účinne zabrániť kontaminácii aerosólom spôsobenej produktmi PCR.
Krok 5: Pridajte reakčnú šablónu
Pri použití technológie Direct PCR nie je potrebný zdĺhavý proces čistenia nukleových kyselín.Šablóna vzorky sa môže pripraviť do 10 minút a pridať do zodpovedajúceho reakčného systému PCR.
Poznámka:
Metóda lýzy má lepší detekčný účinok a získaný produkt je možné použiť na viaceré detekčné reakcie.
5.1: Priama PCR listov
Podľa veľkosti obrázku v návode odrežte listové pletivo s priemerom 2-3mm a vložte do reakčného systému PCR.
Poznámka: Uistite sa, že úlomky listov sú úplne ponorené do reakčného roztoku PCR a nepridávajte nadmerné tkanivo listov.
5.2: Metóda lýzy listov
Odrežte listové pletivo s priemerom 5-7 mm a vložte ho do centrifugačnej skúmavky.Ak si vyberiete zrelé listy, vyhnite sa použitiu pletív hlavnej žilky listu.Napipetujte 50 ul lyzátu pufra P1 do centrifugačnej skúmavky, aby ste sa uistili, že lyzát môže úplne ponoriť tkanivo listov, umiestnite ho do termocykléra alebo kovového kúpeľa a lýzujte pri 95 °C počas 5-10 minút.
Pridajte 50 ul neutralizačného roztoku pufra P2 a dobre premiešajte.Výsledný lyzát môže byť použitý ako templát a pridaný do PCR reakčného systému.
Poznámka: Množstvo templátu by malo byť medzi 5 – 10 % systému PCR a nemalo by presiahnuť 20 % (napríklad v systéme 20 μl PCR pridajte 1 – 2 μl lyzačného pufra, nie viac ako 4 μl).
Krok 6: Reakcia PCR
Po odstredení skúmavky s PCR reakciou ich umiestnite do prístroja PCR na amplifikáciu.
Poznámka:
Reakcia využíva na amplifikáciu nepurifikovaný templát, takže počet amplifikačných cyklov je o 5-10 cyklov viac ako pri použití purifikovaného templátu DNA.
Krok 7: Detekcia elektroforézy a analýza výsledkov
M: 100 bp DNA rebrík
1\4: Metóda purifikovanej DNA
2\5: Priama metóda PCR
3\6: Prázdny ovládací prvok
Kontrola kvality:
Výsledky testov rôznych kontrol nastavených v experimente by mali spĺňať nasledujúce podmienky.V opačnom prípade by sa mala analyzovať príčina problému a po odstránení problému by sa mal test vykonať znova.
Tabuľka 1. Normálne výsledky testov rôznych kontrolných skupín
*Keď sa plazmid použije ako pozitívna kontrola, výsledok testu endogénneho génu môže byť negatívny
Výsledok rozsudku:
Odpoveď: Výsledok testu endogénneho génu vzorky je negatívny, čo naznačuje, že DNA vhodnú na bežnú detekciu PCR nemožno zo vzorky extrahovať alebo extrahovaná DNA obsahuje inhibítory reakcie PCR a DNA by sa mala extrahovať znova.
B. Výsledok testu endogénneho génu vzorky je pozitívny a výsledok testu exogénneho génu je negatívny, čo naznačuje, že DNA vhodná na bežnú PCR detekciu je extrahovaná zo vzorky a možno usúdiť, že gén XXX sa vo vzorke nezistil.
C. Výsledok testu endogénneho génu vzorky je pozitívny a výsledok testu exogénneho génu je pozitívny, čo naznačuje, že DNA vhodná na bežnú PCR detekciu bola extrahovaná zo vzorky a DNA vzorky obsahuje gén XXX.Potvrdzovacie experimenty sa môžu vykonávať ďalej.
Krok 8: Navrhnite detekčné primery
Po experimente použite 2% roztok chlórnanu sodného a 70% roztok etanolu na utretie experimentálnej plochy, aby ste zabránili znečisteniu životného prostredia.
Dodatok
Tabuľka 2. Bežne používané priméry na všeobecnú PCR detekciu geneticky modifikovaných rastlín
Referenčný dokument:
SN/T 1202-2010, Kvalitatívna metóda detekcie PCR geneticky modifikovaných rastlinných zložiek v potravinách.
Oznámenie Ministerstva pôdohospodárstva 1485-5-2010, Testovanie zložiek geneticky modifikovaných rastlín a produktov z nich – ryže M12 a jej derivátov.
Čas odoslania: jún-09-2021
