COVID-19 je infekčné ochorenie spôsobené ťažkým akútnym respiračným syndrómom Coronavirus typu 2. Keď je osoba infikovaná, medzi najčastejšie príznaky patrí horúčka, kašeľ a dýchavičnosť.

Vzorky použité na testovanie možno odobrať výterom z nosohltanu alebo orofaryngeálnym výterom.

Čo je to PCR?

Štandardnou metódou detekcie koronavírusu je polymerázová reťazová reakcia, PCR.Ide o metódu široko používanú v molekulárnej biológii.Dokáže rýchlo skopírovať milióny až miliardy špecifických fragmentov DNA.

Nový koronavírus obsahuje veľmi dlhý jednovláknový RNA genóm.Aby sa tieto vírusy detegovali pomocou PCR, molekuly RNA sa musia previesť na ich komplementárne sekvencie DNA pomocou reverznej transkriptázy a potom sa novosyntetizovaná DNA môže amplifikovať štandardnými postupmi PCR, ktoré sú bežne známe ako RT-PCR.

RT-PCR proces

Extrakcia RNA

Na vykonanie tejto metódy by sa v podstate mala extrahovať vírusová RNA.Na pohodlnú, rýchlu a efektívnu separáciu možno použiť rôzne súpravy na čistenie RNA.

Ak chcete extrahovať vírusovú RNA pomocou komerčnej súpravy, najskôr pridajte vzorku do mikrocentrifugačnej skúmavky a potom ju zmiešajte s lyzačným pufrom.Tento pufer je vysoko denaturovaný a zvyčajne pozostáva z fenolu a guanidín izotiokyanátu.Okrem toho sú v lyzovacom pufri zvyčajne prítomné inhibítory RNázy, aby sa zabezpečila izolácia intaktnej vírusovej RNA.

Po pridaní lyzačného pufra pretrepte miešaciu skúmavku pulzom a inkubujte pri izbovej teplote.Vírus sa potom lýzuje za vysoko denaturačných podmienok poskytnutých lyzačným pufrom.

Po lýze vzorky sa na purifikačný postup použije centrifugačná skúmavka.Vzorka sa vloží do centrifugačnej skúmavky a potom sa odstredí.

Tento postup je metódou extrakcie tuhou fázou, v ktorej stacionárna fáza pozostáva zo silikagélovej matrice.

Za optimálnych podmienok soli a pH sa molekuly RNA viažu na membránu oxidu kremičitého.

Súčasne sa odstránia bielkoviny a iné nečistoty.

Po odstredení vložte odstredivkovú skúmavku do čistej zbernej skúmavky, filtrát zlikvidujte a potom pridajte premývací pufor.

Skúmavku znova vložte do centrifúgy, aby sa premývací pufor pretlačil cez membránu.Tým sa z membrány odstránia všetky zostávajúce nečistoty a na silikagéli zostane naviazaná len RNA.

Po premytí vzorky vložte skúmavku do čistej mikrocentrifugačnej skúmavky a pridajte elučný pufor.

Potom sa centrifuguje, aby sa elučný pufor pretlačil cez membránu.Elučný pufor odstraňuje vírusovú RNA z rotačnej kolóny a získava purifikovanú RNA bez proteínov, inhibítorov a iných kontaminantov.

KROK 2

Zmiešaný koncentrát

Po extrakcii vírusovej RNA je ďalším krokom príprava reakčnej zmesi na PCR amplifikáciu.V tomto kroku sa používa koncentrát.Tento koncentrovaný roztok je vopred namiešaný koncentrovaný roztok pozostávajúci z premixu, reverznej transkriptázy, nukleotidov, forward primeru, reverzného primeru, TaqMan sondy a DNA polymerázy.

Nakoniec sa na dokončenie tejto reakčnej zmesi pridá templát RNA.Skúmavky sa premiešajú pulzným vortexovaním a potom sa reakčná zmes vloží do PCR platne.PCR platňa zvyčajne obsahuje 96 jamiek a môže analyzovať viacero vzoriek súčasne.

KROK 3

PCR amplifikácia

Potom vložte platňu do zariadenia PCR, čo je v podstate tepelný cyklovač.

RT-PCR v reálnom čase sa používa na detekciu nového koronavírusu 2019 amplifikáciou cieľovej sekvencie v géne RdrRP, géne E a géne N.Výber cieľového génu závisí od sekvencie priméru a sondy.

Prvým krokom RT-PCR je reverzná transkripcia.Syntetizuje sa prvé vlákno komplementárnej DNA, čo je iniciované PCR reverzným primerom, ktorý sa viaže na komplementárnu časť genómu vírusovej RNA.Potom reverzná transkriptáza pridá nukleotidy DNA na 3' koniec priméru, aby sa syntetizovala DNA komplementárna k vírusovej RNA.Teplota a trvanie tohto kroku závisia od použitých primerov, cieľovej RNA a reverznej transkriptázy.

Ďalej sa použije počiatočný denaturačný krok, ktorý vedie k denaturácii hybridu RNA-DNA.Tento krok je potrebný na aktiváciu DNA polymerázy.Súčasne je inaktivovaná reverzná transkriptáza.

PCR pozostáva zo série tepelných cyklov.Každý cyklus pozostáva z krokov denaturácie, žíhania a predlžovania.

Krok denaturácie zahŕňa zahriatie reakčnej komory na 95 stupňov Celzia a jej použitie na denaturáciu templátu dvojvláknovej DNA.

V ďalšom kroku sa reakčná teplota zníži na 58 stupňov Celzia, čo umožní priamemu priméru napojiť sa na komplementárnu časť jeho jednovláknového templátu DNA.Teplota žíhania priamo závisí od dĺžky a zloženia základného náteru.

V predlžovacom kroku DNA polymeráza syntetizuje nový reťazec DNA, ktorý je komplementárny k reťazcu templátu DNA.Pridaním voľných jadier komplementárnych k templátu v smere 5′ až 3′ od reakčnej zmesi.Teplota tohto kroku závisí od použitej DNA polymerázy.

Po prvom cykle sa získa cieľ dvojvláknovej DNA.

Potom vstúpte do druhého cyklu.Dvojvláknová DNA sa denaturuje, aby sa vytvorili dve jednovláknové molekuly DNA.

V ďalšom kroku sa reakčná teplota zníži, priméry sa anelujú ku každému templátu jednovláknovej DNA a sonda Taq-man sa aneluje na komplementárnu časť cieľovej DNA.

Sonda TaqMan pozostáva z fluorofóru kovalentne spojeného s 5' koncom oligonukleotidovej sondy.Pri excitácii svetelným zdrojom cykléra fluorofór vyžaruje fluorescenciu.Okrem toho je sonda na 3′konci zložená zo zhášadla.Blízkosť reportérového génu k zhášaču bráni detekcii fluorescencie.

V predlžovacom kroku DNA polymeráza syntetizuje nové vlákno.Keď polymeráza dosiahne sondu TaqMan, jej endogénna 5'nukleázová aktivita štiepi sondu a oddelí farbivo od tlmiaceho činidla.

S každým cyklom PCR sa uvoľňuje viac molekúl farbiva, čo vedie k zvýšeniu intenzity fluorescencie úmerne počtu syntetizovaných amplikónov.

Táto metóda umožňuje odhadnúť počet danej sekvencie prítomnej vo vzorke.Počet fragmentov dvojvláknovej DNA sa v každom cykle zdvojnásobí.Preto možno na analýzu veľmi malých vzoriek použiť PCR.

Na meranie fluorescenčného signálu, volfrámovej halogénovej žiarovky, excitačného filtra, reflektora, šošovky, emisného filtra a nabíjacieho zariadenia použite CCD kameru.

KROK 4 Zistiť

Na meranie fluorescenčného signálu, volfrámovej halogénovej žiarovky, excitačného filtra, reflektora, šošovky, emisného filtra a nabíjacieho zariadenia použite CCD kameru.

Filtrované svetlo z lampy sa odráža reflektorom, prechádza cez kondenzorovú šošovku a je zaostrené do stredu každého otvoru.Potom sa fluorescencia vyžarovaná z otvoru odráža od zrkadla, prechádza cez emisný filter a je detekovaná CCD kamerou.V každom cykle PCR môže CCD detegovať samoexcitované svetlo fluorofóru.

Prevádza zachytené svetlo na digitálne dáta.Táto metóda sa nazýva real-time PCR a umožňuje sledovanie priebehu PCR reakcie v reálnom čase.