PCR, viacnásobný PCR, In situ PCR, Reverzná PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Vytriedime si koncepty, kroky a detaily rôznych PCR

Ⅰ. PCR

Polymerázová reťazová reakcia, označovaná ako PCR, je molekulárna biologická technológia, ktorá sa používa na zväčšenie špecifických fragmentov DNA.Možno to považovať za špeciálnu replikáciu DNA in vitro.DNA polymeráza (DNA Polymerase I) bola objavená už v roku 1955 a Klenowov fragment E. Coli, ktorý má experimentálnu hodnotu a praktickosť, objavil Dr. H. Klenow začiatkom 70. rokov, ale keďže tento enzým neznáša teplotu, vysoká teplota ho môže degenerovať, takže nespĺňa polymerázovú reťazovú reakciu s degeneráciou pri vysokej teplote.Enzýmy, ktoré sa dnes používajú (nazývané Taq polymeráza), boli izolované z Thermus aquaticus, baktérie z horúcich prameňov v roku 1976. Jeho charakteristikou je, že odoláva vysokým teplotám a je ideálnym enzýmom, no vo veľkej miere sa používa až po 80. rokoch.Pôvodný koncept pôvodného primitívneho prototypu PCR je podobný génovej oprave a kopírovaniu, ktorú navrhol Dr. KJell Kleppe v roku 1971. Publikoval prvú jednoduchú a krátkodobú génovú kópiu (podobnú reakciám v prvých dvoch cykloch PCR).Dnes vyvinutú PCR vyvinul Dr. Kary B. Mullis v roku 1983. Dr. Mullis v tom roku slúžil PE spoločnostiam, takže PE má v priemysle PCR špeciálne postavenie.Dr. Mullis oficiálne publikoval prvý súvisiaci článok so Saikim a ďalšími v roku 1985. Odvtedy je použitie PCR tisícky míľ denne a dá sa povedať, že kvalita súvisiacich dokumentov spôsobuje, že mnohé iné výskumné metódy sú nechutné.Následne sa technológia PCR široko používa v biologickom vedeckom výskume a klinických aplikáciách a stáva sa najdôležitejšou technológiou výskumu molekulárnej biológie.Mullis tiež získal v roku 1993 Nobelovu cenu za chémiu.

PCRPrincíp

Základný princíp technológie PCR je podobný prirodzenému procesu replikácie DNA a jej špecifickosť závisí od oligonukleotidového priméru, ktorý je komplementárny k obom koncom cieľovej sekvencie.PCR sa skladá z troch základných reakčných krokov degenerácia-žíhanie-predlžovanie: ①Degenerácia templátovej DNA: Po zahriatí templátovej DNA na približne 93°C na určitú dobu sa roztok s dvojitou DNA pre dvojreťazcovú DNA vytvorený PCR amplifikáciou odchodu templátovej DNA vytvorí z jedného reťazca, aby sa mohol skombinovať s primérom v ďalšom kole a pripraviť sa na ďalšiu reakciu.②Žíhanie (zlúčenina) templátovej DNA a priméru: Po zahriatí templátovej DNA a jej degenerácii do jedného reťazca teplota klesne na približne 55 °C.Komplementárna sekvencia jednoreťazcového priméru a templátovej DNA.③Predĺženie priméru: templát DNA – väzba priméru je založená na pôsobení TaqDNA polymerázy s dNTP ako reakčnou surovinou.Zachovajte princíp replikácie, syntetizujte nový polovyhradený reťazec kópií, ktorý dopĺňa reťazec templátovej DNA, a opakujte cyklus degenerácia-žíhanie-predlžovanie tri procesy môžu získať viac „polorezervovaného reťazca kópií“ a tento nový reťazec je opäť dostupný Staňte sa vzorom pre ďalší cyklus.Dokončenie slučky trvá 2-4 minúty, cieľový gén sa môže amplifikovať niekoľko miliónov krát za 2-3 hodiny.

ŠtandardnéPCRReakčný systém

Päť prvkov PCR reakcie

V PCR reakcii sa zúčastňuje hlavne päť druhov látok, a to primer, enzým, dNTP, templát a pufor (vyžaduje sa Mg2+).[Postup PCR]

Štandardný proces PCR je rozdelený do troch krokov

1. Degenerácia DNA (90°C-96°C): Dvojreťazcové templáty DNA pri tepelnom pôsobení sa prerušia vodíkové väzby, čím sa vytvorí jednoreťazcová DNA.

2. Žíhanie (25 °C -65 °C): Teplota systému sa zníži, primér sa spojí s templátom DNA, čím sa vytvorí lokálny dvojreťazec.

3. Predĺženie (70℃ -75℃): Pôsobením enzýmu Taq (okolo 72°C, najlepšia aktivita) sa dNTP používa ako surovina, siaha od 5′ konca primeru → 3′ konca, syntéza a templát sa navzájom dopĺňajú reťazcom DNA.

Každý cyklus je denaturovaný, žíhaný a predĺžený, čím sa zdvojnásobuje obsah DNA.V súčasnosti je možné kvôli krátkej amplifikačnej oblasti niektoré PCR replikovať vo veľmi krátkom čase, aj keď aktivita enzýmu Taq nie je optimálna, takže sa dá zmeniť na dva kroky, to znamená, že žíhanie a predlžovanie sa môžu vykonávať súčasne pri 60°C-65°C.S cieľom znížiť proces zdvíhania a chladenia a zlepšiť rýchlosť odozvy.

Vlastnosti PCR reakcie

● Vysoká špecifickosť

Špecifické rozhodujúce faktory reakcie PCR sú: ①Špecifická kombinácia primeru a templátovej DNA.②Princíp párovania báz.③Vernosť reakcie syntézy polymerázy TaqDNA.④Špecifickosť a konzervatívnosť cieľového génu.

Kľúčom je správna kombinácia primerov a šablón.Väzba primeru a templátu a predĺženie reťazca primeru sú založené na princípe párovania alkalických báz.Vernosť reakcií syntézy polymerázy a odolnosť Taq DNA polymerázy voči vysokej teplote na vytvorenie väzby (zlúčeniny) templátu a primeru v reakcii sa môže uskutočniť pri vyššej teplote.Špecifickosť kombinácie je značne zvýšená.Klip dokáže zachovať vysoký stupeň správnosti.Výberom cieľovej genetickej oblasti s vysokou konzervatívnosťou a vysokou konzervatívnosťou je jej špecificita vyššia.

● Vysoká citlivosť

Objem produkcie produktov PCR sa zvyšuje o index, ktorý môže rozšíriť počiatočný templát Pickera (PG=10-12) na zvýšenie úrovne mikrokontroléra na úroveň mikrogramov (μg= -6).Cieľové bunky možno detegovať z 1 milióna buniek;pri detekcii vírusov môže citlivosť PCR dosiahnuť 3 RFU (prázdne miesta tvoria jednotky);minimálna miera detekcie v bakteriálnej vede sú 3 baktérie.

● Jednoduché a rýchle

Reflexia PCR využíva vysokoteplotnú Taq DNA polymerázu, ktorá pridáva reakčný roztok naraz, to znamená reakciu degenerácie-žíhania-predlžovania na DNA amplifikačný roztok a nádobu s vodným kúpeľom.Vo všeobecnosti je amplifikačná reakcia ukončená za 2 až 4 hodiny.Rozšírené produkty sa vo všeobecnosti analyzujú elektrickým mečom a nemusia používať izotopy, žiadne rádioaktívne znečistenie a jednoduchú propagáciu.

● Čistota vzorky je nízka

Nie je potrebné separovať vírusy alebo baktérie a kultivovať bunky.Surové produkty DNA a RNA sa môžu použiť ako zosilňovače.Detekcia amplifikácie DNA sa môže použiť priamo pomocou klinických vzoriek, ako je krv, telesná tekutina, tekutina na umývanie kašľa, vlasy, bunky a živé tkanivo.

PCRbežné problémy

● Falošne negatívny, žiadne zosilnené pásy

Kľúčové fázy PCR reakcie zahŕňajú: ① prípravu templátových nukleových kyselín, ② kvalitu a špecifickosť primerov, ③ kvalitu enzýmov ④ podmienky cyklu PCR.Hľadanie dôvodu by sa malo tiež analyzovať a študovať pre vyššie uvedené odkazy.

Šablóny: ① Šablóna obsahuje rôzny proteín, ② Šablóna obsahuje inhibítor enzýmu Taq, ③ Proteín v šablóne nie je eliminovaný, najmä skupinový proteín v chromozóme.⑤ Demineralizácia nukleovej kyseliny nie je dôkladná.Keď je kvalita enzýmov a primerov dobrá, neexistuje žiadny amplifikačný pás, čo je s najväčšou pravdepodobnosťou tráviace ošetrenie vzoriek.V procese extrakcie templátovej nukleovej kyseliny nie je niečo v poriadku, takže na prípravu účinného a stabilného roztoku trávenia by mal byť jeho postup pevne stanovený a nie svojvoľne zmenený.

Inaktivácia enzýmu: nový enzým alebo staré aj nové enzýmy by sa mali použiť spoločne na analýzu, či je aktivita enzýmu stratená alebo nedostatočná, čo vedie k falošne negatívnym výsledkom.Treba poznamenať, že niekedy sa zabúda na enzým Taq alebo etídium bromid.

Primer: kvalita priméru, koncentrácia priméru a či je koncentrácia dvoch primérov symetrická.Je to bežný dôvod zlyhania PCR alebo zväčšujúci sa pás nie je ideálny a náchylný na difúziu.Pri niektorých číslach šarží sú problémy s kvalitou primerov.Dva priméry majú vysokú koncentráciu a nízku koncentráciu, čo spôsobuje asymetrickú amplifikáciu s nízkou účinnosťou.Protiopatrenia sú: ① Vyberte si dobrý primer na syntézu jednotiek.② Koncentrácia primeru nezávisí len od hodnoty OD, ale venuje pozornosť aj pôvodnej kvapaline primeru, aby sa uskutočnila elektroforéza na agarovom cukrovom géli.Musí existovať zóna základného náteru a jas oboch základných náterov by mal byť vo všeobecnosti konzistentný.Belt, PCR môže v tomto čase zlyhať a malo by sa to vyriešiť pomocou jednotky na syntézu primérov.Ak je základný náter vysoký, jas je nízky a jeho koncentrácia musí byť po zriedení vyrovnaná.③ Základný náter by mal byť zaplatený a skladovaný vo vysokej koncentrácii, aby sa predišlo viacnásobnému zmrazeniu alebo dlhodobému chladeniu častí chladničky, ktoré spôsobí znehodnotenie a degradáciu základného náteru.④ Návrh základného náteru je nerozumný, napríklad dĺžka základného náteru je nedostatočná a medzi základnými nátermi sa vytvára diklaster.

Koncentrácia Mg2+: Koncentrácia Mg2+ iónov má veľký vplyv na účinnosť amplifikácie PCR.Nadmerná koncentrácia môže znížiť opačné pohlavie amplifikácie PCR.Ak je koncentrácia príliš nízka, výstup amplifikácie PCR dokonca spôsobí zlyhanie amplifikácie PCR bez expanzného pásma.

Zmena reakčného objemu: Objem použitý pri PCR amplifikácii je 20 ul, 30 ul a 50 ul alebo 100 ul, veľký objem aplikácie na PCR amplifikáciu je nastavený podľa rôznych účelov vedeckého výskumu a klinického testovania.Po zhotovení malých objemov ako 20ul je potrebné pri výrobe veľkosti urobiť šnúrovú podmienku, inak zlyhá.

Fyzikálne dôvody: Transformácia je veľmi dôležitá pre PCR amplifikáciu.Ak je teplota degenerácie nízka, doba degenerácie je krátka, pravdepodobne sa vyskytne vo falošne negatívnych výsledkoch;príliš nízka teplota žíhania môže spôsobiť nešpecifickú amplifikáciu a znížiť špecifickú účinnosť amplifikácie.Výrazne ovplyvňuje kombináciu primérov a templátov, aby sa znížila účinnosť amplifikácie PCR.Niekedy je potrebné použiť štandardné teplomery na zistenie variability, žíhania a predĺženej teploty v predlžovacom alebo vo vode rozpustnom variči, čo je jednou z príčin zlyhania PCR.

Varianty cieľovej sekvencie: Ak dôjde k cieľovej sekvencii, dôjde k mutácii alebo delécii, skombinuje sa kombinácia prototypu a templátu alebo v dôsledku chýbajúcej cieľovej sekvencie primér a templát stratia komplementárnu sekvenciu a jej PCR amplifikácia nebude úspešná.

● Falošne pozitívne

Pás amplifikácie PCR sa zdá byť konzistentný s pásom cieľovej sekvencie a niekedy je jeho pás čistejší a vyšší.

Návrh priméru nie je vhodný: vybraná amplifikačná sekvencia a neúčelová amplifikačná sekvencia sú homológne, takže pri amplifikácii PCR sú amplifikované produkty PCR neúčelové sekvencie.Cieľová sekvencia je príliš krátka alebo primér je príliš krátky a je náchylný na falošne pozitívne výsledky.Treba prerobiť.

Krížové znečistenie cieľovej sekvencie alebo produktov amplifikácie: Existujú dva dôvody tohto znečistenia: Po prvé, krížové znečistenie celého genómu alebo veľkých segmentov, čo vedie k falošným pozitívam.Tento druh falošne pozitívnych výsledkov možno vyriešiť nasledujúcimi metódami: Počas prevádzky buďte opatrní a opatrní, aby ste zabránili vdýchnutiu cieľovej sekvencie do pištole na vzorky alebo vystreknutiu z odstredivej skúmavky.Okrem enzýmov a látok, ktoré neznesú vysoké teploty, by sa všetky činidlá alebo zariadenia mali dezinfikovať vysokým tlakom.Odstredivé rúrky a vzorky by sa mali použiť naraz.Ak je to potrebné, pred pridaním vzoriek sa reakčná skúmavka a činidlo vystavia ultrafialovým lúčom, aby sa zničila existujúca nukleová kyselina.Po druhé, malé úlomky v znečistení ovzdušia.Tieto malé fragmenty sú kratšie ako cieľová sekvencia, ale majú určitú homológiu.Dá sa navzájom spájať.Po doplnení primerov môže byť produkt PCR expandovaný, čo spôsobí falošne pozitívnu produkciu.Môže sa použiť na zníženie alebo odstránenie metódy nest PCR.

● Zobrazte nešpecifické pásmo zosilnenia

Pásy, ktoré sa objavili po PCR amplifikácii, sú nekonzistentné s očakávanou veľkosťou, alebo sú veľké alebo malé, alebo súčasne alebo v rovnakom čase, špecifické amplifikačné pásy a nešpecifické amplifikačné pásy.Vznik nešpecifických pásov je nasledujúci: Po prvé, priméry sú neúplné komplementárne k cieľovej sekvencii alebo polymerizácii priméru za vzniku diklastra.Druhým je, že koncentrácia iónov MG2+ je príliš vysoká, teplota žíhania je príliš nízka a počet cyklov PCR súvisí.Po druhé, kvalita a množstvo enzýmov.Často sú enzýmy z niektorých zdrojov náchylné na nešpeciálne pásy a enzýmy z iného zdroja sa nevyskytujú.Niekedy dochádza aj k nešpecifickej amplifikácii enzýmov.Protiopatrenia sú: v prípade potreby prerobte atraktivity.Znížte množstvo enzýmu alebo nahraďte enzým z iného zdroja.Znížte množstvo primárnych, primerane zvýšte množstvo šablón a znížte počet cyklov.Správne zvýšte teplotu žíhania alebo použite metódu dvoch teplotných bodov (93°C degenerácia, žíhanie a predlžovanie pri cca 65°C).

● Zdá sa, že kúdeľ sa odlupuje alebo sa rozmazáva páska

Niekedy sa zdá, že PCR amplifikácia je aplikovaná alebo škrupina alebo pás podobný kobercu.Z dôvodu nadmerného množstva enzýmov alebo nízkej kvality enzýmu je koncentrácia dNTP príliš vysoká, koncentrácia Mg2+ príliš vysoká, teplota žíhania je príliš nízka a počet cyklov je príliš veľký.Protiopatrenia sú: ①Znížte množstvo enzýmov alebo zmeňte enzým z iného zdroja.②Znížte koncentráciu dNTP ③Správne znížte koncentráciu Mg2+.④Zvýšte množstvo šablón a znížte počet cyklov.

Súvisiace produkty

PCR Heroᵀᴹ (s farbivom)

◮ Vyššia presnosť: 6-krát vyššia ako u bežného enzýmu Taq;

◮ Vyššia rýchlosť zosilnenia

◮ Väčšia prispôsobivosť šablóny

◮ Vyššia účinnosť zosilnenia

◮ Tolerancia prostredia je silnejšia: umiestnite pri teplote 37 °C na týždeň, pričom si zachováva viac ako 90 % aktivitu;

◮ Má 5'→3' DNA polymerázovú aktivitu a 5'→3' exonukleázovú aktivitu, bez 3'→5' exonukleázovej aktivity.

PCR Easyᵀᴹ (s farbivom)

Jedinečný reakčný systém a vysokoúčinná Taq DNA polymeráza spôsobujú, že PCR reakcia má vyššiu účinnosť amplifikácie, špecifickosť a citlivosť.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Jednokroková súprava robí reverznú transkripciu a qPCR dve reakcie v tej istej skúmavke, stačí pridať templátovú RNA, špecifické PCR priméry a ddH bez RNázy₂O.

◮ Súprava dokáže rýchlo a efektívne kvantitatívne analyzovať vírusovú RNA alebo stopovú RNA.

◮ Súprava využíva jedinečné reverzné transkripčné činidlo Foregene a DNA polymerázu Foregene HotStar Taq v kombinácii s jedinečným reakčným systémom na efektívne zlepšenie účinnosti amplifikácie a špecifickosti reakcie.

◮ Vďaka optimalizovanému reakčnému systému má reakcia vyššiu citlivosť detekcie, silnejšiu tepelnú stabilitu a lepšiu toleranciu.

◮ Jednoduché RT-qPCR^TMSúprava (One Step)-SYBR Green I sa dodáva s interným referenčným farbivom ROX, ktoré možno použiť na odstránenie signálneho pozadia a chýb signálu medzi jamkami, čo je pre zákazníkov vhodné na použitie v rôznych modeloch kvantitatívnych PCR prístrojov.

RT Jednoduché^TMII (Master Premix pre syntéza prvého vlákna cDNA prePCR v reálnom čase)

-Efektívna schopnosť odstrániť gDNA, ktorá dokáže odstrániť gDNA v šablóne do 2 minút.

-Efektívny systém reverznej transkripcie, dokončenie syntézy prvého vlákna cDNA trvá len 15 minút.

-Komplexné šablóny: šablóny s vysokým obsahom GC a komplexnou sekundárnou štruktúrou môžu byť tiež obrátené s vysokou účinnosťou.

- Vysoko citlivý systém reverznej transkripcie, šablóny na úrovni pg môžu tiež získať vysokokvalitnú cDNA.

- Systém reverznej transkripcie má vysokú tepelnú stabilitu, optimálna reakčná teplota je 42 ℃ a stále má dobrý výkon reverznej transkripcie pri 50 ℃.