Hodnota Ct je najdôležitejšou formou prezentácie výsledkov fluorescenčnej kvantitatívnej PCR.Používa sa na výpočet rozdielov v génovej expresii alebo počtu génových kópií.Aká je teda hodnota Ct kvantifikácie fluorescencie považovaná za primeranú?Ako zabezpečiť efektívny rozsah hodnoty Ct?
Čo je hodnota Ct?
Počas procesu amplifikácie qPCR zodpovedajúci počet cyklov amplifikácie (Cycle Threshold), keď fluorescenčný signál amplifikovaného produktu dosiahne nastavený prah fluorescencie.C znamená Cycle a T znamená Threshold.Jednoducho povedané, hodnota Ct je počet cyklov zodpovedajúci tomu, keď počiatočná amplifikácia šablóny dosiahne určité množstvo produktu v qPCR.Takzvané „určité množstvo produktu“ bude podrobnejšie vysvetlené neskôr.
Čo robí hodnota Ct?
1. Vzťah medzi exponenciálnou amplifikáciou, množstvom šablóny a hodnotou Ct
V ideálnom prípade sa gény v qPCR akumulujú exponenciálnou amplifikáciou po určitom počte cyklov.Vzťah medzi počtom amplifikačných cyklov a množstvom produktov je: Množstvo amplifikovaného produktu = počiatočné množstvo templátu × (1+En) počet cyklov.Reakcia qPCR však nie je vždy v ideálnej situácii.Keď množstvo amplifikovaného produktu dosiahne „určité množstvo produktu“, počet cyklov v tomto čase je hodnota Ct a je v perióde exponenciálnej amplifikácie.Vzťah medzi hodnotou Ct a množstvom počiatočnej šablóny: Medzi hodnotou Ct šablóny a logaritmom čísla počiatočnej kópie šablóny existuje lineárny vzťah.Čím vyššia je počiatočná koncentrácia templátu, tým menšia je hodnota Ct;čím nižšia je počiatočná koncentrácia templátu, tým väčšia je hodnota Ct.
2. Amplifikačná krivka, prah fluorescencie a určité množstvo produktu PCR
Množstvo produktu amplifikácie qPCR je priamo prezentované vo forme fluorescenčného signálu, to znamená amplifikačnej krivky.V počiatočnom štádiu PCR je amplifikácia za ideálnych podmienok, počet cyklov je malý, akumulácia produktu je malá a úroveň fluorescencie sa nedá jasne odlíšiť od fluorescenčného pozadia.Potom sa fluorescencia zvyšuje a vstupuje do exponenciálnej fázy.Množstvo produktu PCR je možné detegovať v určitom bode, keď je reakcia PCR práve v exponenciálnej fáze, ktorú možno použiť ako „určité množstvo produktu“ a z toho možno odvodiť počiatočný obsah templátu.Preto intenzita fluorescenčného signálu zodpovedajúca určitému množstvu produktu je prah fluorescencie.
V neskoršom štádiu PCR amplifikačná krivka už nevykazuje exponenciálnu amplifikáciu a vstupuje do lineárnej fázy a fázy plató.
3. Reprodukovateľnosť hodnôt Ct
Keď cyklus PCR dosiahne číslo cyklu hodnoty Ct, práve vstúpil do skutočnej exponenciálnej amplifikačnej periódy.V tomto čase malá chyba nebola zosilnená, takže reprodukovateľnosť hodnoty Ct je vynikajúca, to znamená, že rovnaký templát je zosilnený v rôznych časoch alebo v rôznych skúmavkách súčasne.Amplifikácia, získaná hodnota Ct je konštantná.
1.Účinnosť zosilnenia En
Účinnosť amplifikácie PCR sa týka účinnosti, s ktorou polymeráza premieňa gén, ktorý sa má amplifikovať, na amplikón.Účinnosť amplifikácie pri transformácii jednej molekuly DNA na dve molekuly DNA je 100 %.Účinnosť amplifikácie sa bežne vyjadruje ako En.Na uľahčenie analýzy nasledujúcich článkov sú stručne uvedené faktory, ktoré ovplyvňujú účinnosť zosilnenia.
| Ovplyvňujúce faktory | vysvetlenie | Ako súdiť? |
| A. Inhibítory PCR | 1. Templátová DNA obsahuje látky, ktoré inhibujú PCR reakciu, ako sú proteíny alebo detergenty.2. cDNA po reverznej transkripcii obsahuje vysokú koncentráciu templátovej RNA alebo zložiek RT činidla, ktoré môžu tiež inhibovať následnú PCR reakciu. | 1. Či ide o znečistenie, možno posúdiť meraním pomeru A260/A280 a A260/A230 alebo elektroforézou RNA.2. Či je cDNA po reverznej transkripcii zriedená podľa určitého pomeru. |
| B. Nesprávny návrh základného náteru | Základné nátery nežíhajú efektívne | Skontrolujte primery, či neobsahujú primery-diméry alebo vlásenky, nesúlad a niekedy preklenutie intronických návrhov. |
| C. Nesprávny návrh programu reakcie PCR | 1. Priméry nemôžu účinne žíhať2. Nedostatočné uvoľňovanie DNA polymerázy 3. Znížila sa dlhodobá aktivita DNA polymerázy pri vysokej teplote | 1. Teplota žíhania je vyššia ako hodnota TM priméru2. Čas pred denaturáciou je príliš krátky 3. Čas každej fázy reakčného postupu je príliš dlhý |
| D. Nedostatočné premiešanie činidiel alebo chyby pri pipetovaní | V reakčnom systéme je lokálna koncentrácia zložiek PCR reakcie príliš vysoká alebo nerovnomerná, čo vedie k neexponenciálnej amplifikácii PCR amplifikácie | |
| E. Dĺžka amplikónu | Dĺžka amplikónu je príliš dlhá, presahuje 300 bp a účinnosť zosilnenia je nízka | Skontrolujte, či je dĺžka amplikónu medzi 80-300 bp |
| F. Vplyv činidiel qPCR | Koncentrácia DNA polymerázy v činidle je nízka alebo koncentrácia iónov v pufri nie je optimalizovaná, čo vedie k tomu, že aktivita enzýmu Taq nedosahuje maximum | Stanovenie účinnosti amplifikácie štandardnou krivkou |
2.Rozsah hodnôt Ct
Hodnoty Ct sa pohybujú v rozmedzí 15-35.Ak je hodnota Ct nižšia ako 15, predpokladá sa, že amplifikácia je v rozsahu základnej periódy a prah fluorescencie sa nedosiahol.V ideálnom prípade existuje lineárny vzťah medzi hodnotou Ct a logaritmom počiatočného počtu kópií šablóny, to znamená štandardnej krivky.Prostredníctvom štandardnej krivky, keď je účinnosť amplifikácie 100 %, je vypočítaná hodnota Ct na kvantifikáciu počtu jednotlivých kópií génu okolo 35. Ak je väčšia ako 35, počiatočný počet kópií templátu je teoreticky menší ako 1, čo možno považovať za nezmyselné.
Pre rôzne rozsahy Ct génu je v dôsledku rozdielu v počte kópií génu a účinnosti amplifikácie v počiatočnom množstve templátu potrebné vytvoriť štandardnú krivku pre gén a vypočítať lineárny rozsah detekcie génu.
3. Faktory ovplyvňujúce hodnotu Ct
Zo vzťahu medzi počtom cyklov amplifikácie a množstvom produktu: množstvo amplifikovaného produktu = množstvo počiatočného templátu × (1+En) počet cyklov možno vidieť, že za ideálnych podmienok bude mať množstvo počiatočného templátu a En negatívny vplyv na hodnotu Ct.Rozdiel v kvalite šablóny alebo účinnosti amplifikácie spôsobí, že hodnota Ct bude príliš veľká alebo príliš malá.
4. Hodnota Ct je príliš veľká alebo príliš malá
Čas odoslania: 22. februára 2023
