Strata sluchu (HL) je najčastejším zmyslovým postihnutím u ľudí.Vo vyspelých krajinách je asi 80 % prípadov prelingválnej hluchoty u detí spôsobených genetickými faktormi.Najčastejšie ide o defekty jedného génu (ako je znázornené na obr. 1), zistilo sa, že 124 génových mutácií súvisí s nesyndromovou poruchou sluchu u ľudí, ostatné sú spôsobené faktormi prostredia.Kochleárny implantát (elektronické zariadenie umiestnené vo vnútornom uchu, ktoré poskytuje elektrickú stimuláciu priamo do sluchového nervu) je zďaleka najefektívnejšou možnosťou na liečbu závažnej HL, zatiaľ čo načúvací prístroj (externé elektronické zariadenie, ktoré konvertuje a zosilňuje zvukové vlny) môže pomôcť pacientom so stredne ťažkou HL.V súčasnosti však nie sú dostupné žiadne lieky na liečbu dedičnej HL (GHL).V posledných rokoch sa génovej terapii venuje zvýšená pozornosť ako sľubnému prístupu k liečbe dysfunkcie vnútorného ucha.

Obr.Distribúcia typu variácie súvisiacej s hluchotou.[1]

Vedci zo Salkovho inštitútu a Sheffieldskej univerzity nedávno publikovali výsledok výskumu Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], ktorý ukázal široké možnosti využitia in vivo génovej terapie dedičnej hluchoty.Uri Manor, odborný asistent výskumu v Salkovom inštitúte a riaditeľ Waittovho centra pre pokročilú biofotoniku, povedal, že sa narodil s ťažkou stratou sluchu a cítil, že obnovenie sluchu by bol úžasný dar.Jeho predchádzajúci výskum zistil, že Eps8 je aktínový regulačný proteín s aktivitami viazania a uzatvárania aktínu;v kochleárnych vláskových bunkách sa proteínový komplex tvorený Eps8 s MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 a GNAI3 vyskytuje hlavne vo väčšine Končeky dlhých stereocílií, ktoré spolu s MYO15A lokalizujú BAIAP2L2 na špičkách kratších stereocílií, sú potrebné na udržanie vlasových zväzkov.Preto môže Eps8 regulovať dĺžku stereocílie vláskových buniek, čo je nevyhnutné pre normálnu funkciu sluchu;Vymazanie alebo mutácia Eps8 povedie ku krátkej stereocílii, ktorá znemožňuje správnu konverziu zvuku na elektrické signály pre vnímanie mozgu, čo následne vedie k hluchote..Spolupracovník Walter Marcotti, profesor na univerzite v Sheffielde, zároveň zistil, že vláskové bunky sa bez Eps8 nemôžu normálne vyvíjať.V tejto štúdii sa Manor a Marcotti spojili, aby zistili, či pridanie Eps8 do stereociliárnych buniek môže obnoviť ich funkciu a následne zlepšiť sluch u myší.Výskumný tím použil adeno-asociovaný vírusový (AAV) vektor Anc80L65 na dodanie kódujúcej sekvencie obsahujúcej divoký typ EPS8 do slimáka Eps8-/- novonarodených myší P1-P2 injekciou membrány s okrúhlym okienkom;v kochleárnych vláskových bunkách myší Funkcia stereocílie bola opravená skôr, ako dozreli;a opravný efekt bol charakterizovaný zobrazovacou technológiou a meraním stereocílie.Výsledky ukázali, že Eps8 zvýšil dĺžku stereocilie a obnovil funkciu vlasových buniek v nízkofrekvenčných bunkách.Zistili tiež, že postupom času sa zdalo, že bunky strácajú svoju schopnosť zachrániť sa touto génovou terapiou.Dôsledkom je, že túto liečbu možno bude potrebné podávať in utero, pretože vláskové bunky Eps8-/- mohli dozrieť alebo nahromadiť poškodenie, ktoré sa nedá opraviť potom, čo sa myši narodili.„Eps8 je proteín s mnohými rôznymi funkciami a stále je čo skúmať,“ povedal Manor.Budúci výskum bude zahŕňať skúmanie účinku génovej terapie Eps8 na obnovenie sluchu v rôznych vývojových štádiách a či je možné predĺžiť možnosti liečby.Zhodou okolností v novembri 2020 profesor KarenB Avraham z Tel Avivskej univerzity v Izraeli publikoval svoje výsledky v časopise EMBO Molecular Medicine [3] s použitím inovatívnej technológie génovej terapie na vytvorenie neškodného syntetického adeno-asociovaného vírusu AAV9-PHP.B, Génový defekt vo vláskových bunkách myší Syne4-/- bol opravený injekciou vírusu nesúceho kódujúcu sekvenciu Syne4 do vnútorného ucha myší, čo mu umožnilo vstúpiť do vláskových buniek a uvoľniť prenášaný genetický materiál, čo im umožnilo dozrieť a normálne fungovať (ako na obr. 2).

Obr.Schematické znázornenie anatómie vnútorného ucha so zameraním na Cortiho orgán a bunkovú funkciu nesprinu-4.

Je zrejmé, že použitie génovej terapie na dosiahnutie účelu liečby dedičných chorôb na génovej úrovni vložením, odstránením alebo korekciou akýchkoľvek zmutovaných génov na liečbu (to znamená kontrola genetických zmien v chorobe) má vysoký klinický účinok.vyhliadky na uplatnenie.Súčasné metódy génovej terapie geneticky nedostatočnej hluchoty možno rozdeliť do nasledujúcich kategórií:

nahradenie génov

Génová náhrada je pravdepodobne „najpriamejšia“ forma génovej terapie, založená na identifikácii a nahradení defektného génu normálnou alebo divokou kópiou génu.Prvá úspešná štúdia génovej terapie vnútorného ucha pre stratu sluchu spôsobenú deléciou génu vezikulárneho glutamátového transportéra 3 (VGLUT3);Dodanie exogénnej nadmernej expresie VGLUT3 vo vláskových bunkách vnútorného ucha (IHC) sprostredkované AAV1 môže viesť k trvalému zotaveniu sluchu, čiastočnému zotaveniu stuhovej synaptickej morfológie a konvulzívnym reakciám [4].V príkladoch zahŕňajúcich dve náhrady génov dodávaných AAV opísaných v úvode vyššie je však dôležité poznamenať, že myšacie modely používané na určité typy dedičných porúch sluchu s deléciou génu sú dočasne odlišné od ľudských a u myší P1 je vnútorné ucho v zrelom štádiu vývoja.Naproti tomu ľudia sa rodia so zrelým vnútorným uchom.Tento rozdiel bráni možnej aplikácii výsledkov na myšiach na liečbu ľudských dedičných porúch hluchoty, pokiaľ sa génová terapia neaplikuje do uší zrelých myší.

Génová úprava: CRISPR/Cas9

V porovnaní s „náhradou génov“ vývoj technológie úpravy génov priniesol úsvit liečby genetických chorôb od koreňa.Dôležité je, že metóda úpravy génov kompenzuje nedostatky tradičných metód génovej terapie s nadmernou expresiou, ktoré nie sú vhodné pre dominantné dedičné choroby hluchoty, a problém, že metóda nadmernej expresie netrvá dlho.Po tom, čo čínski vedci špecificky vyradili mutantnú alelu Myo6C442Y u myší Myo6WT/C442Y pomocou systému na úpravu génov AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2, a do 5 mesiacov od knockoutu sa u myší obnovila sluchová funkcia modelu;súčasne sa tiež pozorovalo, že sa zlepšila miera prežitia vláskových buniek vo vnútornom uchu, tvar mihalníc sa stal pravidelným a elektrofyziologické ukazovatele sa upravili [5].Toto je prvá štúdia na svete, ktorá využíva technológiu CRISPR/Cas9 na liečbu dedičnej hluchoty spôsobenej mutáciou génu Myo6, a je to dôležitý pokrok vo výskume technológie úpravy génov na liečbu dedičnej hluchoty.Klinický preklad liečby poskytuje solídny vedecký základ.

Metódy podávania génovej terapie

Aby bola génová terapia úspešná, molekuly nahej DNA nemôžu účinne prenikať do buniek v dôsledku ich hydrofilnosti a negatívneho náboja fosfátových skupín a na zabezpečenie integrity molekúl doplnených nukleových kyselín je potrebné zvoliť bezpečný a účinný spôsob.Doplnená DNA sa dodáva do cieľovej bunky alebo tkaniva.AAV sa široko používa ako dodávacie vehikulum na liečbu chorôb kvôli svojmu vysokému infekčnému účinku, nízkej imunogenicite a širokému tropizmu do rôznych typov tkanív.V súčasnosti veľké množstvo výskumných prác určilo tropizmus rôznych podtypov AAV v porovnaní s rôznymi typmi buniek v kochlei myši.Použitím charakteristík dodávania AAV v kombinácii s bunkovo ​​špecifickými promótormi je možné dosiahnuť bunkovo ​​špecifickú expresiu, ktorá môže znížiť účinky mimo cieľa.Okrem toho, ako alternatíva k tradičným AAV vektorom, sa neustále vyvíjajú nové syntetické AAV vektory a vykazujú vynikajúcu transdukčnú schopnosť vo vnútornom uchu, z ktorých AAV2/Anc80L65 je najpoužívanejší.Metódy nevírusového podávania možno ďalej rozdeliť na fyzikálne metódy (mikroinjekcia a elektroporácia) a chemické metódy (na báze lipidov, polymérov a nanočastíc zlata).Oba prístupy sa použili pri liečbe dedičných porúch hluchoty a ukázali rôzne výhody a obmedzenia.Okrem dodávacieho vehikula pre génovú terapiu ako vehikula sa môžu použiť rôzne prístupy na podávanie génov in vivo na základe rôznych typov cieľových buniek, ciest podávania a terapeutickej účinnosti.Zložitá štruktúra vnútorného ucha sťažuje dosiahnutie cieľových buniek a distribúcia činidiel upravujúcich genóm je pomalá.Membranózny labyrint sa nachádza v kostnom labyrinte spánkovej kosti a zahŕňa kochleárny kanál, polkruhový kanál, utrikul a balónik.Jeho relatívna izolácia, minimálna lymfatická cirkulácia a oddelenie od krvi bariérou medzi krvou a bludiskom obmedzujú účinné systémové dodávanie terapeutík iba novorodeným myšiam.Na získanie vírusových titrov vhodných na génovú terapiu je potrebná priama lokálna injekcia vírusových vektorov do vnútorného ucha.Zavedené spôsoby injekcie zahŕňajú [6]: (1) membránu s okrúhlym okienkom (RWM), (2) tracheostómiu, (3) endolymfatickú alebo perilymfatickú kochleostómiu, (4) membránu s okrúhlym okienkom plus fenestráciu trubice (CF) (ako na obr. 3).

Obr.Dodávanie génovej terapie do vnútorného ucha.

Aj keď sa v génovej terapii urobilo veľa pokrokov, na základe klinických translačných cieľov je potrebné vykonať viac práce, kým sa génová terapia stane prvolíniovou možnosťou liečby pre pacientov s genetickými ochoreniami, najmä pri vývoji bezpečných a účinných vektorov a spôsobu podávania.Veríme však, že v blízkej budúcnosti sa tieto typy liečby stanú základom personalizovanej terapie a budú mať mimoriadne pozitívny vplyv na životy ľudí s genetickými poruchami a ich rodiny.

Foregene tiež uviedol na trh vysokovýkonnú skríningovú súpravu pre cielené gény, ktorá je rýchla a dokáže vykonávať reverznú transkripciu a qPCR reakcie bez extrakcie RNA.

Odkazy na produkty

Súprava Cell Direct RT-qPCR—Taqman/SYBR GREEN I

Pre viac informácií o produkte kontaktujte:

overseas@foregene.com