Vynikajúcou vlastnosťou PCR reakcie je jej veľká amplifikačná kapacita a extrémne vysoká citlivosť.Aby sme zlepšili výkon PCR a účinnosť detekcie, zaviazali sme sa zlepšiť kapacitu amplifikácie PCR a citlivosť detekcie, ale bolesť hlavy je v procese experimentu.Často sa vyskytujú falošne pozitívne výsledky a veľmi malé množstvo krížovej kontaminácie vzorky alebo kontaminácie produktu PCR môže spôsobiť falošné pozitíva v experimente.
Päť typov kontaminácie produktov PCR
Existuje mnoho dôvodov kontaminácie PCR, ktoré možno zhruba rozdeliť do nasledujúcich kategórií:
Kontaminácia vzorky je spôsobená najmä kontamináciou nádoby na odber vzorky alebo keď je vzorka umiestnená, vyteká z nádoby v dôsledku uvoľneného tesnenia, alebo je vzorka prilepená na vonkajšiu stranu nádoby, čo spôsobuje krížovú kontamináciu;Kontaminácia vedie ku kontaminácii medzi vzorkami;niektoré mikrobiálne vzorky, najmä vírusy, sa môžu šíriť aerosólmi alebo vytvárať aerosóly, čo vedie k vzájomnej kontaminácii.
Hlavným dôvodom je, že počas prípravy PCR činidiel sú vzorkovacia pištoľ, nádoba, dvakrát destilovaná voda a iné roztoky kontaminované templátom nukleovej kyseliny PCR.
V laboratóriách molekulárnej biológie a niektorých laboratóriách, ktoré používajú klonované plazmidy ako pozitívne kontroly, je tiež bežný problém kontaminácie klonovaných plazmidov.Pretože obsah klonovacieho plazmidu v jednotkovom objeme je dosť vysoký a v procese čistenia je potrebných viac nástrojov a činidiel, je veľmi pravdepodobné, že plazmid v živých bunkách bude kontaminovaný v dôsledku silného rastu a reprodukčnej schopnosti živých buniek.
Kontaminácia amplifikovaných produktov je najčastejším problémom kontaminácie pri PCR reakciách.Pretože množstvo kópií produktu PCR je veľké (zvyčajne 1013 kópií/ml), čo je oveľa viac ako limit počtu kópií na detekciu PCR, veľmi malé množstvo kontaminácie produktu PCR môže spôsobiť falošné pozitíva.
Znečistenie aerosólom je najpravdepodobnejšou formou kontaminácie produktov PCR a je tiež najjednoduchšie ho prehliadnuť.Vzniká trením medzi povrchom kvapaliny a vzduchom.Vo všeobecnosti sa aerosólová kontaminácia môže vytvoriť, keď sa otvorí veko, keď sa vzorka odsaje, alebo aj keď sa reakčná skúmavka energicky pretrepe.Aerosólová častica môže podľa výpočtov obsahovať 48 000 kópií, preto je ňou spôsobené znečistenie problémom, ktorý si zaslúži osobitnú pozornosť.
Najmä testovacie laboratóriá často používajú rovnaký pár primérov na testovanie určitého génu.V priebehu času dôjde v laboratórnych priestoroch k veľkému množstvu kontaminácie produktov PCR.Keď už k takejto kontaminácii dôjde, je ťažké ju v krátkom čase odstrániť.
Pri prvých troch typoch znečistenia môžeme použiť účinné prostriedky, ako sa im vyhnúť, ale znečisteniu spôsobenému produktmi PCR je ťažké zabrániť, najmä pri výstavbe neštandardných laboratórií PCR.V procese PCR, keď špička pipety nasáva a vyfukuje kvapalinu a kryt skúmavky PCR sa otvorí, vytvorí sa aerosól.Molekuly DNA prenášané aerosólom (jeden aerosól môže niesť desaťtisíce DNA) sa ťažko eliminujú, pretože sa vznášajú vo vzduchu.Po zavedení ďalšieho kola PCR experimentov sa nevyhnutne vyskytnú falošné pozitíva.
Ako je znázornené na obrázku nižšie, negatívna kontrola tiež zosilnila zodpovedajúci záujmový pás:
Je tu uvedená prvá časť tejto problematiky znečistenia a prevencie PCR.Ďalšie číslo vám prinesie druhú časť „Prevencia kontaminácie produktov PCR“, tak nás sledujte!
Čas odoslania: 25. júla 2017
