Priama PCR je reakcia, ktorá priamo využíva živočíšne alebo rastlinné tkanivá na amplifikáciu bez extrakcie nukleovej kyseliny.V mnohých ohľadoch funguje priama PCR ako bežná PCR

Hlavným rozdielom je vlastný tlmivý roztok používaný v priamej PCR, vzorka môže byť priamo podrobená PCR reakcii bez extrakcie nukleovej kyseliny, existujú však zodpovedajúce požiadavky na toleranciu enzýmov a kompatibilitu tlmivého roztoku zapojeného do priamej PCR reakcie.

Hoci v bežných vzorkách je viac či menej inhibítorov PCR, priama PCR môže stále dosiahnuť spoľahlivú amplifikáciu pôsobením enzýmov a pufrov.Tradičná PCR reakcia vyžaduje vysokokvalitnú nukleovú kyselinu ako templát, ktorý môže inhibovať hladký priebeh PCR reakcie, ak templát obsahuje proteíny a iné nečistoty.Priama PCR je v súčasnosti jednou z najpopulárnejších technológií v oblasti molekulárnej diagnostiky.

01 Direct PCR sa pôvodne používal pre zvieratá a rastliny

Najskoršia aplikácia priamej PCR je v oblasti zvierat a rastlín, ako je krv, tkanivo a vlasy potkanov, mačiek, kurčiat, králikov, oviec, hovädzieho dobytka atď., listy a semená rastlín atď., Používa sa na štúdium genotypizácie, transgénnosti, detekcie plazmidov, analýzy génového knockoutu, identifikácie zdroja DNA, identifikácie druhov, analýzy SNP a ďalších oblastí.

Tieto polia majú niektoré spoločné znaky, to znamená, že obsah cieľového génu je relatívne vysoký a extrakcia nukleových kyselín je problematická, takže priama PCR môže nielen ušetriť čas a mať malý vplyv na výsledky, ale aj ušetriť náklady.

Priama PCR používaná na detekciu patogénov je záležitosťou posledných rokov, niektorí výrobcovia PCR činidiel vynaložili pri inováciách v tomto smere veľa úsilia.Najmä v tejto epidémii COVID-19 sa na trhu objavilo mnoho takýchto produktov na detekciu, ako napríklad súprava na detekciu SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) skúmaná a vyvinutý spoločnosťou Foregene, ktorá využíva technológiu Real-time RT PCR (rRT-PCR) na kvalitatívnu detekciu vzoriek SARS-CoV-CoV-2 inhalačných nukleárnych jadierok

Foregene je jednou zo spoločností, ktoré používajú technológiu Direct PCR na detekciu normálnych ORF1ab, N, E avarianta línií nukleových kyselín vo vzorkách ľudských nazofaryngeálnych alebo orofaryngeálnych výterov, ako je línia SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), línia B.1.351 (ZA), línia B.1.617 (IND) a línia P.1 (BR).

02  Činidlá potrebné pre priamu PCR

Lyzát vzorky

Lyzát vzorky si môžete sami nakonfigurovať alebo si ho môžete zakúpiť.Rozdiel v zložení rôznych značiek lyzátu spôsobí, že schopnosť lýzy sa bude líšiť a potom bude aj čas lýzy mierne odlišný.Napríklad na prípravu vzoriek živočíšneho tkaniva sa vo všeobecnosti odporúča 30 minútová alebo nočná lýza a lyzačný roztok pre vírusy je v rozsahu 3 až 10 minút.

PCR master mix

Na zvýšenie špecifickej amplifikácie a zvýšenie schopnosti amplifikácie sa odporúča použiť hot-start DNA polymerázu.Jadrom priamej PCR je vysoko tolerantná polymeráza.

Odstráňte alebo inhibujte zložky vo vzorke, ktoré ovplyvňujú amplifikáciu DNA

Po spracovaní vzorky s lyzátom sa uvoľnia proteíny, lipidy a iné zvyšky buniek, ktoré budú inhibovať reakciu PCR.Preto priama PCR vyžaduje pridanie zodpovedajúceho odstránenia alebo inhibítorov na zníženie vplyvu týchto faktorov.

03  Zbierka piatich vedomostných bodov priamej PCR

Po prvé, technológia Direct PCR je priama technológia PCR pre rôzne biologické vzorky.Za týchto technických podmienok nie je potrebné separovať a extrahovať nukleovú kyselinu, priamo použiť vzorku tkaniva ako objekt a pridať priméry cieľového génu na uskutočnenie PCR reakcie.

Po druhé, technológia Direct PCR nie je len tradičnou technológiou amplifikácie templátu DNA, ale zahŕňa aj reverznú transkripčnú PCR templátu RNA.

Po tretie, technológia Direct PCR nielen priamo vykonáva rutinné kvalitatívne PCR reakcie na tkanivových vzorkách, ale zahŕňa aj reakcie qPCR v reálnom čase, čo vyžaduje, aby reakčný systém mal silnú schopnosť interferencie s fluorescenciou na pozadí a endogénna fluorescencia zhášala antagonistickú schopnosť.

Po štvrté, vzorky cielené technológiou Direct PCR potrebujú iba uvoľnenie templátov nukleových kyselín a neodstraňujú proteíny, polysacharidy, ióny solí atď., ktoré interferujú s reakciou PCR.Čo vyžaduje, aby polymeráza nukleových kyselín a zmes PCR v reakčnom systéme mali vynikajúcu odolnosť a adaptabilitu na zabezpečenie aktivity enzýmu a presnosti replikácie v zložitých podmienkach.

Po piate, vzorka tkaniva cielená technológiou Direct PCR bez akéhokoľvek ošetrenia obohatením nukleovými kyselinami a množstvo templátu je veľmi malé, čo vyžaduje, aby mal reakčný systém extrémne vysokú citlivosť a účinnosť amplifikácie.