Verím, že každý sa pri PCR reakciách vždy stretne s takým či onakým problémom, no väčšinu z nich možno rozdeliť do dvoch hlavných problémov:

Príliš malá amplifikácia génového templátu (amplifikácia);
Príliš veľa necieľovej génovej amplifikácie.
Používanie prísad je jednou z bežných stratégií na riešenie týchto problémov.Úloha prísad má zvyčajne dva aspekty:
sekundárna štruktúragénov (sekundárna štruktúra);
Znížte nešpecifický základný náter.
Dnes vám redaktor v krátkosti predstaví bežné aditíva v PCR reakciách a ich funkcie.
Prísady, ktoré znižujú sekundárnu štruktúru
sulfoxid(DMSO)
vzorky génovs vysokým obsahom GC .Avšak DMSO tiež výrazne znižuje aktivitu Taq polymerázy.Preto musí každý vyvážiť dostupnosť šablóny a aktivitu polymerázy.Editor navrhuje, že môžete vyskúšať rôzne koncentrácie DSMO, napríklad od 2 % do 10 %, aby ste našli koncentráciu, ktorá vyhovuje vášmu experimentu.
Neiónové detergenty
Neiónové detergenty, ako napríklad 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 alebo NP-40, zvyčajne redukujú sekundárnu štruktúru DNA.Hoci to môže zvýšiť amplifikáciu templátového génu, spôsobí to aj problémy s nešpecifickou amplifikáciou.Takže tieto prísady fungujú dobre pre reakcie PCR s nízkym výťažkom bez zvyškov, ale nie tak dobre pre relatívne nečisté reakcie PRC.Ďalšou výhodou neiónových detergentov je zníženie kontaminácie SDS.Zvyčajne počas procesu extrakcie DNA sa SDS prenesie do kroku PCR, čo výrazne inhibuje aktivitu polymerázy.Preto pridanie 0,5 % Tween-20 alebo Tween-40 do reakcie môže neutralizovať negatívne účinky SDS.
betaín_
Betaín môže zlepšiť amplifikáciu DNA znížením tvorby sekundárnej štruktúry a vo všeobecnosti je „záhadným“ doplnkom komerčných PCR súprav.Ak chcete použiť betaín, mali by ste pridať betaín alebo monohydrát betaínu (betain alebo betaín monohydrát), ale nie hydrochlorid betaínu (betain HCl), upravte na konečnú koncentráciu 1-1,7 M.Betaín môže tiež pomôcť zlepšiť špecifickosť, pretože eliminuje závislosť zloženia párov báz od topenia DNA/denaturácie DNA.
Prísady na zníženie nešpecifického základného náteru
formamid
Formamid je bežne používaná organická PCR prísada.Môže sa kombinovať s hlavnou drážkou a malou drážkou v DNA, čím sa zníži stabilita dvojitej špirály hlavnej DNA a zníži sa teplota topenia DNA.Koncentrácia formamidu používaná v PCR experimentoch je zvyčajne 1%-5%.
tetrametylchlorid amónny( TMAC)
Tetrametylamóniumchlorid môže zvýšiť špecifickosť hybridizácie (hybridizačná špecifickosť) a zvýšiť teplotu topenia DNA.TMAC teda môže odstrániť nešpecifické priming a znížiť chybné viazanie DNA a RNA.Ak používatedegenerované priméryv reakcii PCR nezabudnite pridať TMAC, ktorý sa bežne používa v koncentrácii 15-100 mM.
Ďalšie bežné aditíva
Okrem dvoch vyššie uvedených kategórií aditív existuje v PCR reakciách mnoho bežných aditív, hoci majú rôzne funkcie, sú tiež veľmi dôležité.
Horčíkový ión
Horčíkový ión je nevyhnutný kofaktor (kofaktor) polymerázy, to znamená, že bez horčíkového iónu je polymeráza neaktívna.Avšak príliš veľa horčíkových iónov môže tiež ovplyvniť účinnosť polymerázy.Koncentrácia horčíkových iónov v každej PCR reakcii sa bude líšiť.Chelatačné činidlá (ako je EDTA alebo citrát), koncentrácia dNTP a proteínov ovplyvňujú koncentráciu horčíkových iónov.Ak teda máte problémy s experimentom PCR, môžete skúsiť zmeniť rôzne koncentrácie horčíkových iónov, napríklad z 1,0 na 4,0 mM, s intervalom 0,5 – 1 mM medzi nimi.
Stojí za zmienku, že viacero cyklov zmrazovania a rozmrazovania môže viesť k stratifikácii koncentrácie roztoku chloridu horečnatého.Preto ho pred každým použitím musíte úplne rozpustiť a pred použitím dobre premiešať.
Hovädzí sérový albumín(Hovädzí albumín, BSA)
V experimentoch molekulárnej chémie je hovädzí sérový albumín veľmi bežnou prísadou, najmä pri štiepení reštrikčnými enzýmami a pri experimentoch PCR.V PCR reakciách je BSA nápomocný pri znižovaní kontaminantov, ako sú fenolové zlúčeniny.A tiež sa hovorí, že dokáže znížiť priľnavosť reaktantov na stenu skúmavky.Pri PCR reakcii môže zvyčajne koncentrácia pridaného BSA dosiahnuť 0,8 mg/ml.
 
Súvisiace produkty:
Hrdina PCR(s farbivom)
Hrdina PCR