Autori: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Jednotka: Jiaozhou Hospital, Dongfang Hospital Pridružená k Tongji University

V súčasnosti je hlavným typom vzorky na detekciu nukleovej kyseliny respiračného patogénu výter z hrdla.Existuje mnoho druhov bežne používaných roztokov na uchovávanie vzoriek, z ktorých všetky musia byť chladené alebo zmrazené na prepravu a skladovanie;Je ťažké kontrolovať celý proces nízkej teploty počas procesu zberu a prepravy a je ťažké zabezpečiť kontrolu kvality pred testovaním vzorky^[1-2].

RNáza (RNáza) je endonukleáza, ktorá hydrolyzuje RNA, hlavne prerušuje fosfodiesterové väzby medzi nukleotidmi.Molekula RNázy je veľmi stabilná, v štruktúre sú disulfidové väzby a jej aktivita nevyžaduje prítomnosť dvojmocných katiónov, takže RNáza nie je ľahko denaturovaná a ľahko sa renaturuje aj po vysokej teplote alebo použití denaturantov.RNázy sa delia na endogénne a exogénne.Endogénne RNázy sa môžu uvoľniť v rovnakom čase, keď sú bunky roztrhnuté.Preto je eliminácia úlohy endogénnych RNáz veľmi kritickým krokom v procese extrakcie RNA.Exogénne RNázy sú široko distribuované.RNázy existujú vo vzduchu, ľudskej koži, vlasoch a slinách, čo sú dôležité dôvody pre ľahkú degradáciu RNA^[3].

Dotaz na údaje

CANS-CL02-A009 „Aplikácia usmernení pre akreditáciu kvality a spôsobilosti medicínskych laboratórií v oblasti molekulárnej diagnostiky“ v technických požiadavkách navrhuje, aby sa podľa aplikácie sformulovali vhodné normy kvality vody;Jednorazové vzduchotesné nádoby:

RNáza/Klasifikácia

(1) RNáza A

Ribonukleáza A (RNáza A), odvodená z hovädzieho pankreasu, je endoribonukleáza, ktorá môže špecificky atakovať 3' koniec pyrimidínových zvyškov na RNA, pričom štiepi cytozín alebo uracil tvorený susednými nukleotidmi.Fosfodiesterová väzba, konečným produktom reakcie je 3′ pyrimidínový nukleotid a oligonukleotid s 3′ pyrimidínovým nukleotidom na konci.

(2) RNáza T1

Ribonukleáza T1 (RNáza T1) pochádza z Aspergillus orjzae, špecificky pôsobí na 3'-koncový fosfát guanínu a miesto štiepenia je medzi 3' fosfátom guanínu a 5' hydroxylom susedných nukleotidov.Konečným produktom reakcie je kyselina 3′guanylová a oligonukleotidové fragmenty s kyselinou 3′guanylovou na konci.

(3) RNáza H

Ribonukleáza H (RNáza H) bola prvýkrát objavená z tkaniva teľacieho týmusu a jej kódujúci gén bol klonovaný do Escherichia coli.Dokáže špecificky degradovať DNA: RNA vlákna v hybridných duplexoch RNA, výsledkom čoho sú oligonukleotidy a mononukleotidy s 3′-OH a 5′-monofosfátovými koncami, nedokáže degradovať jedno- alebo dvojvláknovú DNA alebo RNA.

RNáza

Funkcia a použitie

Ribonukleáza môže katalyzovať degradáciu ribonukleovej kyseliny (RNA) a môže sa syntetizovať umelo.Liečivá masť sa používa lokálne na liečbu traumy a bolesti kĺbov.Podľa správ môže ribonukleáza zmeniť metabolizmus hostiteľskej bunky, inhibovať syntézu vírusu, inhibovať proliferáciu vírusu chrípky in vitro a inhibovať tvorbu vírusu vakcínie a herpesu v kuracích embryách.Klinické použitie ribonukleázy dennej intramuskulárnej injekcie 180 mg, prospešnej pri liečbe epidemickej encefalitídy, môže ribonukleáza katalyzovať degradáciu ribonukleovej kyseliny (RNA) a teraz ju možno umelo syntetizovať.Liečivá masť sa používa lokálne na liečbu traumy a bolesti kĺbov.Podľa správ môže ribonukleáza zmeniť metabolizmus hostiteľskej bunky, inhibovať syntézu vírusu, inhibovať proliferáciu vírusu chrípky in vitro a inhibovať tvorbu vírusu vakcínie a herpesu v kuracích embryách.Klinické použitie ribonukleázy denne intramuskulárnou injekciou 180 mg je prospešné pri liečbe epidemickej encefalitídy.

RNáza

Definícia inhibítora

Definícia jednotky inhibítora RNázy: Množstvo enzýmu potrebné na inhibíciu 50 % aktivity 5 ng RNázy A je jedna jednotka.

Ako fungujú inhibítory RNázy

Guanidín izotiokyanát:

Guanidín izotiokyanát je organická zlúčenina s molekulovým vzorcom C2H6N4S.Používa sa hlavne v biologickej medicíne, chemických činidlách atď. Guanidín izotiokyanát je činidlo na lýzu proteínov a často sa používa ako hlavná zložka lyzačného roztoku v molekulárnych diagnostických činidlách.Dokáže lyzovať tkanivo, zničiť bunkovú štruktúru a disociovať nukleovú kyselinu z nukleoproteínu a má silnú denaturáciu na RNázu.V súčasnosti je to najúčinnejší inhibítor RNázy.

TRIzol je nové činidlo na extrakciu celkovej RNA, ktoré môže priamo extrahovať celkovú RNA z buniek alebo tkanív.Obsahuje látky ako fenol a guanidín izotiokyanát, ktoré dokážu rýchlo narušiť bunky a inhibovať nukleázy uvoľňované bunkami.

(Avšak guanidín izotiokyanát je nebezpečný pre zdravie laboratórnych výskumníkov.)

RNasin:

Kyslý glykoproteín extrahovaný z pečene potkana alebo ľudského blastodermu.Rnasin je nekompetitívny inhibítor RNázy, ktorý sa môže viazať na rôzne RNázy a inaktivovať ich.

(Viac podrobností: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hvysoká teplota:

Vysoká teplota je tiež bežným prostriedkom denaturácie bielkovín.

Dietylpyrokarbonát (DEPC):

DEPC je silný, ale neúplný inhibítor RNázy, ktorý môže inhibovať aktivitu RNázy spojením s aminokyselinovým imidazolovým kruhom aktívnej skupiny RNázy na denaturáciu proteínov.

Vanadyl ribonukleozidový komplex:

Komplex tvorený iónmi oxidu vanádu a nukleozidmi, ktorý sa viaže na RNázu vo forme prechodných látok, ktoré môžu takmer úplne inhibovať aktivitu RNázy

iné:

Určitý inhibičný účinok na RNázu má aj SDS, močovina, kremelina atď.

Odborné posudky

Li Yujie hlavný technik

Riaditeľ oddelenia laboratórií, nemocnica Jiaozhou, nemocnica Dongfang Pridružená k univerzite Tongji

Aby sa zabránilo biodegradácii exogénnej RNázy, mali by sa počas procesu extrakcie RNA často nosiť a vymieňať masky, rukavice a klobúky.Všetky sklenené výrobky sa musia piecť v sušiarni pri teplote 200 °C dlhšie ako 2 hodiny.Materiály používané na pečenie, ako sú plasty, musia byť ošetrené DEPC vodou a potom umyté destilovanou vodou.Činidlá alebo zariadenia používané na extrakciu, konzerváciu a identifikáciu RNA by mali byť určené pre RNA a mala by sa zriadiť nezávislá prevádzková oblasť RNA.

referencie:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J a kol.Baktérie a vírusy v nazofarynxe bezprostredne pred nástupom akútnych infekcií dolných dýchacích ciest u domorodých austrálskych detí[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785-1794.

[2] Oddelenie kontroly nemocničných infekcií Čínskej asociácie preventívnej medicíny.Pokyny pre odber a kontrolu klinických mikrobiálnych vzoriek [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] „Klinický test desaťtisíc dôvodov, prečo sa testuje objem molekulárnej biológie“