一、Zvýšte citlivosť reakčného systému：

1. Izolujte vysokokvalitnú RNA：

Úspešná syntéza cDNA pochádza z vysoko kvalitnej RNA.Vysokokvalitná RNA by mala byť aspoň v plnej dĺžke a bez inhibítorov reverznej transkriptázy, ako sú EDTA alebo SDS.Kvalita RNA určuje maximálne množstvo sekvenčných informácií, ktoré môžete prepísať do cDNA.Bežnou metódou purifikácie RNA je jednokroková metóda využívajúca guanidín izotiokyanát/kyselý fenol.Aby sa zabránilo kontaminácii stopovým množstvom RNázy, RNA izolovaná zo vzoriek bohatých na RNázu (ako je pankreas) sa musí skladovať vo formaldehyde, aby sa zachovala vysokokvalitná RNA, najmä na dlhodobé skladovanie.RNA extrahovaná z potkanej pečene bola v podstate degradovaná po skladovaní vo vode po dobu jedného týždňa, zatiaľ čo RNA extrahovaná z potkanej sleziny zostala stabilná po skladovaní vo vode po dobu 3 rokov.Okrem toho sú transkripty dlhšie ako 4 kb citlivejšie na degradáciu stopovými RNázami ako malé transkripty.Na zvýšenie stability uskladnených vzoriek RNA možno RNA rozpustiť v deionizovanom formamide a skladovať pri -70 °C.Formamid používaný na zachovanie RNA nesmie obsahovať zvyšky degradujúce RNA.RNA z pankreasu môže byť zachovaná vo formamide aspoň jeden rok.Pri príprave na použitie RNA môžete na vyzrážanie RNA použiť nasledujúcu metódu: pridajte NaCl do 0,2 M a 4-násobku objemu etanolu, umiestnite na 3-5 minút pri izbovej teplote a 5 minút odstreďujte pri 10 000 × g.

2. Použite RNaseH-inaktívnu (RNaseH-) reverznú transkriptázu：

Inhibítory RNázy sa často pridávajú na reverzné transkripčné reakcie, aby sa zvýšila dĺžka a výťažok syntézy cDNA.Inhibítory RNázy by sa mali pridávať počas reakcie syntézy prvého vlákna v prítomnosti pufra a redukčného činidla (ako je DTT), pretože proces pred syntézou cDNA denaturuje inhibítor, čím sa uvoľní naviazaná RNáza, ktorá môže degradovať RNA.Inhibítory proteínovej RNázy zabraňujú iba degradácii RNA RNázou A, B, C a nezabraňujú RNáze na koži, takže dávajte pozor, aby ste si napriek použitiu týchto inhibítorov nezaviedli RNázu z prstov.

Reverzná transkriptáza katalyzuje konverziu RNA na cDNA.M-MLV aj AMV majú okrem svojej vlastnej polymerázovej aktivity aj endogénnu aktivitu RNázyH.Aktivita RNázyH a aktivita polymerázy si navzájom konkurujú o hybridný reťazec vytvorený medzi RNA templátom a DNA primerom alebo predlžovacím reťazcom cDNA a degradujú reťazec RNA v komplexe RNA:DNA.Templát RNA degradovaný aktivitou RNázyH už nemôže slúžiť ako účinný substrát pre syntézu cDNA, čo znižuje výťažok a dĺžku syntézy cDNA.Preto by bolo prospešné eliminovať alebo výrazne znížiť aktivitu RNázyH reverznej transkriptázy.

SuperScript Ⅱ reverzná transkriptáza, RNázaH-MMLV reverzná transkriptáza a termoScriptová reverzná transkriptáza, RNázaH-AMV, môžu získať väčšie množstvo a viac cDNA s plnou dĺžkou ako MMLV a AMV.Citlivosť RT-PCR bude ovplyvnená množstvom syntézy cDNA.ThermoScript je oveľa citlivejší ako AMV.Veľkosť produktov RT-PCR je obmedzená schopnosťou reverznej transkriptázy syntetizovať cDNA, najmä pri klonovaní väčších cDNA.V porovnaní s MMLV, SuperScripⅡ výrazne zvýšil výťažok dlhých produktov RT-PCR.RNaseH-reverzná transkriptáza má tiež zvýšenú termostabilitu, takže reakcia môže byť uskutočnená pri teplotách vyšších ako je normálnych 37-42°C.Pri navrhovaných podmienkach syntézy použite oligo(dT) primér a 10 μCi [a-P]dCTP.Celkový výťažok prvého vlákna bol vypočítaný použitím TCA precipitačnej metódy.Kompletná cDNA sa analyzovala pomocou pásov roztriedených podľa veľkosti, vyrezaných a spočítaných na alkalickom agarózovom géli.

3. Zvýšte inkubačnú teplotu pre reverznú transkripciu:

Vyššia inkubačná teplota pomáha otvoriť sekundárnu štruktúru RNA, čím sa zvyšuje výťažok reakcie.Pre väčšinu RNA templátov inkubácia RNA a primérov pri 65 °C bez pufra alebo soli, nasledovaná rýchlym ochladením na ľade, odstráni väčšinu sekundárnych štruktúr a umožní naviazanie primérov.Niektoré šablóny však stále majú sekundárne štruktúry, dokonca aj po tepelnej denaturácii.Amplifikácia týchto zložitých templátov sa môže uskutočniť pomocou ThermoScript reverznej transkriptázy a umiestnením reakcie reverznej transkripcie pri vyššej teplote, aby sa zlepšila amplifikácia.Vyššie inkubačné teploty môžu tiež zvýšiť špecifickosť, najmä ak sa na syntézu cDNA používajú génovo špecifické priméry (GSP) (pozri kapitolu 3).Ak používate GSP, zabezpečte, aby Tm primerov bola rovnaká ako očakávaná inkubačná teplota.Nepoužívajte oligo(dT) a náhodné priméry nad 60 °C.Náhodné priméry vyžadujú inkubáciu pri 25 °C počas 10 minút pred zvýšením na 60 °C.Okrem použitia vyššej teploty reverznej transkripcie možno špecifickosť zlepšiť aj priamym prenosom zmesi RNA/primér z denaturačnej teploty 65 °C na teplotu inkubácie reverznej transkripcie a pridaním predhriatej 2× reakčnej zmesi (syntéza cDNA s horúcim štartom).Tento prístup pomáha predchádzať párovaniu medzimolekulových báz, ku ktorému dochádza pri nižších teplotách.Viacnásobné prepínanie teplôt potrebné pre RT-PCR je možné zjednodušiť použitím tepelného cyklovača.

Tth termostabilná polymeráza pôsobí ako DNA polymeráza v prítomnosti Mg2+ a ako RNA polymeráza v prítomnosti Mn2+.Môže sa udržiavať v teple pri maximálnej teplote 65°C.Prítomnosť Mn2+ počas PCR však znižuje presnosť, čo robí Tth polymerázu menej vhodnou na vysoko presnú amplifikáciu, ako je klonovanie cDNA.Okrem toho má Tth nízku účinnosť reverznej transkripcie, čo znižuje citlivosť, a keďže reverznú transkripciu a PCR je možné uskutočniť s jediným enzýmom, kontrolné reakcie bez reverznej transkripcie nemožno použiť na porovnanie produktov amplifikácie cDNA s kontaminujúcou genómovou DNA.Produkty amplifikácie boli oddelené.

4. Aditíva, ktoré podporujú reverznú transkripciu:

Do syntézy prvého vlákna sa pridávajú aditíva vrátane glycerolu a DMSO, ktoré môžu znížiť stabilitu dvojvlákna nukleovej kyseliny a uvoľniť sekundárnu štruktúru RNA.Je možné pridať až 20 % glycerolu alebo 10 % DMSO bez ovplyvnenia aktivity SuperScript II alebo MMLV.AMV môže tiež tolerovať až 20 % glycerolu bez straty aktivity.Aby sa maximalizovala citlivosť RT-PCR v reakcii reverznej transkripcie SuperScriptⅡ, môže sa pridať 10% glycerol a inkubovať pri 45 °C.Ak sa do PCR pridá 1/10 reakčného produktu reverznej transkripcie, potom je koncentrácia glycerolu v amplifikačnej reakcii 0,4 %, čo nestačí na inhibíciu PCR.

5. Liečba RNaseH:

Ošetrenie reakcií syntézy cDNA s RNázouH pred PCR môže zvýšiť citlivosť.Pre niektoré templáty sa predpokladá, že RNA v reakcii syntézy cDNA bráni väzbe produktov amplifikácie, v takom prípade môže ošetrenie RNázouH zvýšiť citlivosť.Vo všeobecnosti je liečba RNázouH nevyhnutná pri amplifikácii dlhších cieľových templátov cDNA s plnou dĺžkou, ako je tuberózna scheróza II s nízkymi kópiami.Pre tento náročný templát ošetrenie RNázouH zosilnilo signál produkovaný SuperScript II alebo AMV-syntetizovanou cDNA.Pre väčšinu reakcií RT-PCR je ošetrenie RNázouH voliteľné, pretože krok denaturácie PCR pri 95 °C vo všeobecnosti hydrolyzuje RNA v komplexe RNA:DNA.

6. Zlepšenie metódy detekcie malej RNA:

RT-PCR je obzvlášť náročná, keď sú dostupné len malé množstvá RNA.Glykogén pridaný ako nosič počas izolácie RNA pomáha zvýšiť výťažok malých vzoriek.Glykogén bez RNázy sa môže pridať súčasne s pridaním Trizolu.Glykogén je rozpustný vo vode a môže byť udržiavaný vo vodnej fáze s RNA na uľahčenie následného zrážania.Pre vzorky menšie ako 50 mg tkaniva alebo 106 kultivovaných buniek je odporúčaná koncentrácia glykogénu bez RNázy 250 μg/ml.

Pridanie acetylovaného BSA do reakcie reverznej transkripcie pomocou SuperScript II môže zvýšiť citlivosť a pre malé množstvá RNA zníženie množstva SuperScript II a pridanie 40 jednotiek inhibítora nukleázy RNaseOut môže zvýšiť úroveň detekcie.Ak sa v procese izolácie RNA použije glykogén, stále sa odporúča pridať inhibítor BSA alebo RNázy, keď používate SuperScript II na reakciu reverznej transkripcie.

二、Zvýšiť špecificitu RT-PCR

1. Asyntéza CND:

Syntéza prvého vlákna cDNA môže byť zahájená použitím troch rôznych metód, ktorých relatívna špecifickosť ovplyvňuje množstvo a typ syntetizovanej cDNA.

Metóda náhodného priméru bola z týchto troch metód najmenej špecifická.Priméry anelujú na viacerých miestach v rámci transkriptu a vytvárajú krátke cDNA s čiastočnou dĺžkou.Táto metóda sa často používa na získanie 5' koncových sekvencií a na získanie cDNA z RNA templátov s oblasťami sekundárnej štruktúry alebo s terminačnými miestami, ktoré sa nedajú replikovať reverznou transkriptázou.Na získanie najdlhšej cDNA je potrebné empiricky určiť pomer primérov k RNA v každej vzorke RNA.Počiatočná koncentrácia náhodných primerov sa pohybovala od 50 do 250 ng na 20 μl reakcie.Pretože cDNA syntetizovaná z celkovej RNA pomocou náhodných primérov je primárne ribozomálna RNA, vo všeobecnosti sa ako templát vyberie poly(A)+RNA.

Oligo(dT) priméry sú špecifickejšie ako náhodné priméry.Hybridizuje sa s poly(A) chvostom, ktorý sa nachádza na 3' konci väčšiny eukaryotických mRNA.Pretože poly(A)+ RNA tvorí približne 1 % až 2 % celkovej RNA, množstvo a komplexnosť cDNA je oveľa menšia ako pri náhodných priméroch.Kvôli svojej vysokej špecificite oligo(dT) vo všeobecnosti nevyžaduje optimalizáciu pomeru RNA k primérom a poly(A)+ selekciu.Odporúča sa použiť 0,5 μg oligo(dT) na 20 μl reakčného systému.oligo(dT)12-18 je vhodný pre väčšinu RT-PCR.Systém ThermoScript RT-PCR ponúka oligo(dT)20 kvôli jeho lepšej tepelnej stabilite pri vyšších inkubačných teplotách.

Génové špecifické priméry (GSP) sú najšpecifickejšie priméry pre krok reverznej transkripcie.GSP je antisense oligonukleotid, ktorý môže špecificky hybridizovať s cieľovou sekvenciou RNA, na rozdiel od náhodných primérov alebo oligo(dT), ktoré nasadajú na všetky RNA.Rovnaké pravidlá, aké sa používajú pri navrhovaní primérov PCR, platia pre návrh GSP v reakciách reverznej transkripcie.GSP môže byť rovnaká sekvencia ako amplifikačný primér, ktorý aneluje na 3'-najväčší koniec mRNA, alebo môže byť GSP navrhnutý tak, aby aneloval po smere od reverzného amplifikačného priméru.Pre niektoré amplifikované subjekty je potrebné navrhnúť viac ako jeden antisense primér pre úspešnú RT-PCR, pretože sekundárna štruktúra cieľovej RNA môže brániť naviazaniu priméru.Odporúča sa použiť 1 pmol antisense GSP v 20 μl reakcii syntézy prvého vlákna.

2. Zvýšte inkubačnú teplotu pre reverznú transkripciu:

Aby sa naplno využila výhoda špecifickosti GSP, mala by sa použiť reverzná transkriptáza s vyššou termostabilitou.Termostabilné reverzné transkriptázy sa môžu inkubovať pri vyšších teplotách, aby sa zvýšila prísnosť reakcie.Napríklad, ak GSP aneluje pri 55 °C, špecificita GSP nebude plne využitá, ak sa AMV alebo M-MLV použije na reverznú transkripciu pri nízkej prísnosti 37 °C.Avšak SuperScript II a ThermoScript môžu reagovať pri 50 °C alebo vyššej, čo eliminuje nešpecifické produkty generované pri nižších teplotách.Pre maximálnu špecifickosť možno zmes RNA/primér preniesť priamo z denaturačnej teploty 65 °C na teplotu inkubácie s reverznou transkripciou a pridať do predhriatej 2× reakčnej zmesi (horúce štartovanie syntézy cDNA).To pomáha predchádzať párovaniu medzimolekulových báz pri nízkych teplotách.Viacnásobné teplotné prechody potrebné pre RT-PCR je možné zjednodušiť použitím tepelného cyklovača.

3. Znižuje kontamináciu genómovou DNA：

Potenciálnym problémom, s ktorým sa stretávame pri RT-PCR, je kontaminácia genómovej DNA v RNA.Použitie dobrej metódy izolácie RNA, ako je Trizol Reagent, zníži množstvo genómovej DNA kontaminujúcej prípravok RNA.Aby sa predišlo produktom odvodeným od genómovej DNA, RNA môže byť ošetrená DNázou I amplifikačného stupňa, aby sa pred reverznou transkripciou odstránila kontaminujúca DNA.Štiepenie DNázou I sa ukončilo inkubáciou vzoriek v 2,0 mM EDTA počas 10 minút pri 65 °C.EDTA môže chelátovať horčíkové ióny, čím zabraňuje hydrolýze RNA závislej od horčíkových iónov pri vysokých teplotách.

Aby sa oddelila amplifikovaná cDNA od kontaminujúcich produktov amplifikácie genómovej DNA, môžu sa navrhnúť priméry, aby sa každý aneloval na oddelenie exónov.Produkty PCR odvodené z cDNA budú kratšie ako produkty odvodené z kontaminovanej genómovej DNA.Okrem toho sa na každom templáte RNA uskutočnil kontrolný experiment bez reverznej transkripcie, aby sa určilo, či daný fragment pochádza z genómovej DNA alebo cDNA.Produkt PCR získaný bez reverznej transkripcie pochádza z genómu.