Niekoľko revolučných vynálezov v histórii detekčnej technológie v mojej mysli je technológia imunologického označovania založená na princípe špecifickej väzby antigén-protilátka, technológia PCR a technológia sekvenovania.Dnes budeme hovoriť o technológii PCR.Podľa vývoja technológie PCR ľudia zvyčajne rozdeľujú technológiu PCR do troch generácií: bežnú technológiu PCR, technológiu fluorescenčnej kvantitatívnej PCR v reálnom čase a digitálnu technológiu PCR.
Cbežná technika PCR
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis vynašiel polymerázovú reťazovú reakciu (polymerázová reťazová reakcia, PCR) v roku 1983. Hovorí sa, že keď šoféroval svoju priateľku, odrazu ho popadla inšpirácia a premýšľal o princípe PCR (o výhodách šoférovania).Kary Mullisová bola ocenená Nobelovou cenou za chémiu v roku 1993. The New York Times to komentovali takto: „Veľmi originálna a významná, takmer rozdeľujúca biológiu na obdobie pred PCR a po PCR.
Princíp PCR: Pri katalýze DNA polymerázy sa materské vlákno DNA používa ako templát a špecifický primér sa používa ako východiskový bod predlžovania a dcérske vlákno DNA komplementárne k templátovej DNA materského vlákna sa skopíruje in vitro prostredníctvom denaturácie, žíhania, predlžovania a ďalších krokov.Ide o technológiu amplifikácie syntézy DNA in vitro, ktorá dokáže rýchlo a špecificky amplifikovať akúkoľvek cieľovú DNA in vitro.
Výhody bežnej PCR
1.Klasická metóda, kompletné medzinárodné a domáce štandardy
2.Nižšie náklady na prístrojové činidlá
3.Produkty PCR možno získať pre iné experimenty molekulárnej biológie
Odporúčaný prístroj Foregene PCR: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Súvisiace produkty: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Nevýhody bežnej PCR
1.ľahko znečistiteľné
2.ťažkopádna operácia
3.len kvalitatívna analýza
4.Stredná citlivosť
5.Existuje nešpecifické zosilnenie a keď má nešpecifické pásmo rovnakú veľkosť ako cieľové pásmo, nemožno ho rozlíšiť
CPCR na báze apilárnej elektroforézy
V reakcii na nedostatky bežnej PCR niektorí výrobcovia zaviedli prístroje založené na princípe kapilárnej elektroforézy.Krok elektroforézy po PCR amplifikácii je dokončený v kapiláre.Citlivosť je vyššia a je možné rozlíšiť rozdiel niekoľkých báz a vypočítať amplifikáciu pomocou MAERKER.obsah produktu.Nevýhodou je, že PCR produkt treba stále otvárať a vkladať do prístroja a stále existuje veľké riziko kontaminácie.
CapilárEelektroforéza
2. Technológia fluorescenčnej kvantitatívnej PCR v reálnom čase (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Fluorescenčná kvantitatívna PCR, tiež nazývaná Real-Time PCR, je nová kvantitatívna technológia nukleových kyselín vyvinutá spoločnosťou PE (Perkin Elmer) v roku 1995. História vývoja fluorescenčnej kvantitatívnej PCR je históriou duševných bojov gigantov ako ABI, Roche a Bio-Rad.Ak máte záujem, môžete si to pozrieť.Táto technika je v súčasnosti najvyspelejšou a široko používanou semikvantitatívnou PCR technikou.
Odporúčaný stroj qPCR: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Metóda fluorescenčného farbiva (SYBR Green I):SYBR Green I je najčastejšie používané farbivo viažuce DNA pre kvantitatívnu PCR, ktoré sa nešpecificky viaže na dvojvláknovú DNA.Vo voľnom stave SYBR Green vyžaruje slabú fluorescenciu, ale po naviazaní na dvojvláknovú DNA sa jej fluorescencia zvýši 1000-násobne.Preto je celkový fluorescenčný signál emitovaný reakciou úmerný množstvu prítomnej dvojvláknovej DNA a bude sa zvyšovať so zvyšovaním amplifikovaného produktu.Keďže sa farbivo viaže nešpecificky na dvojvláknovú DNA, môžu sa generovať falošne pozitívne výsledky.
Súvisiace produkty: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Metóda fluorescenčnej sondy (technológia Taqman): PočasPCR amplifikácie, špecifická fluorescenčná sonda je pridaná súčasne s párom primérov.Sonda je lineárny oligonukleotid s fluorescenčnou reportérovou skupinou a fluorescenčnou zhášacou skupinou na oboch koncoch.Keď je sonda neporušená, fluorescenčný signál emitovaný reportérovou skupinou je absorbovaný zhášacou skupinou a detekcia Neexistuje žiadny fluorescenčný signál;počas amplifikácie PCR (v štádiu predlžovania) 5'-3' Dicer aktivita enzýmu Taq natrávi a degraduje sondu, takže reportérová fluorescenčná skupina a zhášacia fluorescenčná skupina sú oddelené, takže systém monitorovania fluorescencie je možné prijímať fluorescenčný signál, to znamená vždy, keď sa zosilní reťazec DNA, vytvorí sa fluorescenčná molekula, ktorá zrealizuje kompletnú tvorbu fluorescenčných signálov PCR.Metóda sondy Taqman je najbežnejšie používanou detekčnou metódou v klinickej detekcii.
Súvisiace produkty: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Výhody qPCR
1.Metóda je zrelá a podporné vybavenie a činidlá sú kompletné
2.Stredné náklady na činidlá
3.jednoduché použitie
4.Vysoká citlivosť a špecifickosť detekcie
Nevýhody qPCR
Mutácia cieľového génu vedie k strate detekcie.
Výsledok detekcie templátu s nízkou koncentráciou nemožno určiť.
Pri použití štandardnej krivky na kvantitatívnu detekciu je veľká chyba.
3. Technológia digitálnej PCR (digital PCR, dPCR).
Digitálna PCR je technika absolútnej kvantifikácie molekúl nukleových kyselín.V porovnaní s qPCR dokáže digitálna PCR priamo čítať počet molekúl DNA/RNA, čo je absolútna kvantifikácia molekúl nukleových kyselín vo východiskovej vzorke.V roku 1999 Bert Vogelstein a Kenneth W. Kin-zler formálne navrhli koncept dPCR.
V roku 2006 spoločnosť Fluidigm ako prvá vyrobila komerčný nástroj dPCR založený na čipoch.V roku 2009 spoločnosť Life Technologies uviedla na trh systémy OpenArray a QuantStudio 12K Flex dPCR.V roku 2013 spoločnosť Life Technologies uviedla na trh systém QuantStudio 3DdPCR, ktorý využíva technológiu mikrofluidných čipov s vysokou hustotou nanometrov na rovnomernú distribúciu vzoriek do 20 000 jednotlivých buniek.v reakčnej dobre.
V roku 2011 spoločnosť Bio-Rad uviedla na trh prístroj QX100 dPCR založený na kvapôčkach, ktorý využíva technológiu voda v oleji na rovnomernú distribúciu vzorky do 20 000 kvapiek vody v oleji a na analýzu kvapiek používa analyzátor kvapiek.V roku 2012 spoločnosť RainDance uviedla na trh nástroj RainDrop dPCR, poháňaný vysokotlakovým plynom, aby rozdelil každý štandardný reakčný systém na reakčnú emulziu obsahujúcu 1 milión až 10 miliónov mikrokvapôčok na úrovni pikolitrov.
Digitálna PCR doteraz vytvorila dve hlavné frakcie, typ čipu a typ kvapôčky.Bez ohľadu na to, aký druh digitálnej PCR, jej hlavnými princípmi sú limitné riedenie, koncová PCR a Poissonova distribúcia.Štandardný PCR reakčný systém obsahujúci templáty nukleových kyselín je rovnomerne rozdelený do desiatok tisíc PCR reakcií, ktoré sú distribuované na čipy alebo mikrokvapôčky tak, aby každá reakcia obsahovala čo najviac templátovej molekuly a uskutočnila sa jednomolekulová templátová PCR reakcia.Odčítaním fluorescencie Prítomnosť alebo neprítomnosť signálu sa spočíta a absolútna kvantifikácia sa uskutoční po kalibrácii štatistickej Poissonovej distribúcie.
Nasledujú charakteristiky niekoľkých digitálnych platforiem PCR, ktoré som použil:
1. Bio-Rad QX200 kvapôčkový digitálny PCR Bio-RadQX200 je veľmi klasická digitálna platforma PCR, základný proces detekcie: 20 000 vzoriek vygeneruje generátor kvapiek Mikrokvapôčky typu voda v oleji sa zosilnia na bežnom stroji PCR a nakoniec sa fluorescenčný signál každej mikrokvapky načíta čítačkou mikrokvapiek.Prevádzka je zložitejšia a riziko znečistenia je stredné.
Xinyi TD1 mikrokvapôčková digitálna PCRXinyi TD1 je domáca digitálna platforma PCR, základný detekčný proces: vygenerujte 30 000 – 50 000 kvapiek vody v oleji prostredníctvom generátora kvapiek, zosilnite sa na bežnom prístroji PCR a nakoniec prejdite Čítačka kvapiek číta fluorescenčný signál každej kvapky.Generovanie kvapôčok aj čítanie na tejto platforme sa vykonáva vo vyhradenom čipe s nízkym rizikom kontaminácie.
STILLA Naica mikrokvapôčkový čip digitálny PCRSTILLA Naica je relatívne nová digitálna platforma PCR.Základný detekčný proces je: pridanie reakčného roztoku do čipu, vloženie čipu do systému generovania a amplifikácie mikrokvapiek a vygenerovanie 30 000 mikrokvapiek.Naneste na čip a PCR amplifikácia je dokončená na čipe.Potom sa zosilnený čip prenesie do systému na analýzu mikrokvapôčok a fluorescenčný signál sa načíta snímaním obrázkov.Keďže celý proces prebieha v uzavretom čipe, riziko kontaminácie je nízke.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D čip digitálny PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D je ďalšia klasická čipová digitálna platforma PCR.Jeho základný detekčný proces je: pridať reakčný roztok do nátierky a rovnomerne rozotrieť reakčný roztok na čip s 20 000 mikrojamkami cez nátierku., vložte čip do prístroja PCR na amplifikáciu a nakoniec vložte čip do čítačky a urobte fotografiu, aby ste mohli prečítať fluorescenčný signál.Operácia je pomerne komplikovaná a celý proces prebieha v uzavretom čipe a riziko kontaminácie je nízke.
5. Digitálna PCR s čipom JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity je relatívne nová digitálna platforma PCR čipového typu.Jeho základný detekčný proces je: pridať reakčný roztok do aplikátora a cez aplikátor rovnomerne rozotrieť reakčný roztok do 10 000 PCR skúmaviek upevnených v PCR skúmavke.Na mikroporéznom čipe sa reakčný roztok dostane do čipu kapilárnym pôsobením a PCR skúmavka s čipom sa umiestni na PCR stroj na amplifikáciu a nakoniec sa čip vloží do čítačky, aby sa odfotografoval fluorescenčný signál.Operácia je zložitejšia.Riziko kontaminácie je nízke.
Parametre každej digitálnej platformy PCR sú zhrnuté takto:
Hodnotiace ukazovatele digitálnej platformy PCR sú: počet rozdelených jednotiek, počet fluorescenčných kanálov, zložitosť prevádzky a riziko kontaminácie.Najdôležitejšia je však presnosť detekcie.Jedným zo spôsobov hodnotenia digitálnych platforiem PCR je použitie viacerých digitálnych platforiem PCR na vzájomné overenie a ďalším spôsobom je použitie štandardných látok s presnými hodnotami.
Výhody dPCR
1.Dosiahnutie absolútnej kvantifikácie
2.Vyššia citlivosť a špecifickosť
3.Dokáže rozpoznať nízke vzorky kópií
Nevýhody dPCR1. Drahé vybavenie a činidlá 2. Zložitá prevádzka a dlhý čas detekcie 3. Úzky rozsah detekcie
V súčasnosti majú tri generácie technológie PCR svoje výhody a nevýhody a každá z nich má svoje vlastné aplikačné oblasti a nejde o vzťah, že jedna generácia nahrádza druhú.Neustály pokrok technológie vniesol novú vitalitu do technológie PCR, ktorá jej umožňuje odomykať jeden smer aplikácie za druhým, vďaka čomu je detekcia nukleových kyselín pohodlnejšia a presnejšia.
Zdroj: Dr. Yuan vás vezme na testovanie
Odporúčané produkty:
Čas odoslania: 18. novembra 2022
