Tradičné reverzné transkriptázy nedokážu tolerovať vysoké teploty (optimálna teplota pre aktivitu MMLV je 37-50 °C a AMV je 42-60 °C).Komplexnejšia vírusová RNA nemôže byť účinne reverzne transkribovaná do cDNA pri nízkych teplotách, čo vedie k zníženiu účinnosti detekcie.Tradičná RT-qPCR vo všeobecnosti vyžaduje účasť dvoch kľúčových enzýmov (reverzná transkriptáza a DNA polymeráza), čo znemožňuje zjednodušiť fungovanie reakčného systému a znížiť náklady.Tu predstavíme dve reverzné transkriptázy odolné voči vysokým teplotám, TtH a RevTaq.Tieto dva enzýmy majú aj funkciu DNA polymerázy, preto sa nazývajú bifunkčné enzýmy.

TtH DNA polymeráza

Určite ste už počuli o TtH, ktorý je odvodený od termofilnej baktérie Thermus thermophilus HB8.V prítomnosti dvojmocných katiónov, ako je Mg2+, má aktivitu DNA polymerázy.Je široko používaný v PCR reakciách ako enzým Taq, ale má vyššiu tepelnú odolnosť ako enzým Taq, takže má tiež lepší účinok na PCR s templátmi s vysokým obsahom GC.

· Tento enzým v zásade nemá žiadnu 3′→5′ exonukleázovú aktivitu a 5′→3′ exonukleázovú aktivitu, takže ho možno použiť aj na dideoxy sekvenovanie.

· Tento enzým má aktivitu RTázy.V prítomnosti Mn2+ sa zvýši aktivita RTázy.Pomocou tejto funkcie sa môže použiť na uskutočnenie reverznej transkripčnej reakcie a PCR reakcie v tej istej skúmavke, to znamená jednokrokovej RT-PCR.Avšak v prítomnosti Mn2+ nie je presnosť RT-PCR vysoká.Aktivita RT nemá nič spoločné s aktivitou rnaázy H.

· Zvýšená aktivita Tth-DNA polymerázy (pH9, optimum +55℃～+70℃, maximum +95℃) prekonáva problémy spôsobené sekundárnou štruktúrou RNA.Výsledná cDNA môže byť amplifikovaná pomocou PCR s rovnakým enzýmom v prítomnosti Mg2+ iónov.

· Schopnosť Tth-DNA polymerázy vykonávať reverznú transkripciu a amplifikáciu DNA pri vysokých teplotách robí tento enzým užitočným pre kvantitatívnu RT-PCR, klonovanie a analýzu génovej expresie bunkovej a vírusovej RNA.
· Tth-DNA polymeráza sa používa pre RT-PCR na amplifikáciu RNA až do 1 kb.

Vlastnosti a výhody

Tth DNA polymeráza:

• Zabezpečte veľkosť produktu optimalizovanej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), aspoň 1000 bp v reakcii RT-PCR

• Prijmite modifikovaný deoxyribonukleozidtrifosfát ako substrát

• Nesúvisí s aktivitou RNázy H

• Má vysokú tepelnú stabilitu na prekonanie problémov, zvyčajne súvisiacich s vysokou sekundárnou štruktúrou prítomnou v RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymeráza

Tepelne odolná DNA polymeráza s aktivitou reverznej transkriptázy

RevTaq-RT-PCR-DNA polymeráza je skonštruovaný, vysoko tepelne odolný, dvojfunkčný enzým s aktivitami reverznej transkriptázy a DNA polymerázy získanými riadenou a umelou evolúciou.

· Polčas rozpadu RevTaq RT-PCR DNA polymerázy pri 95 °C je dlhší ako 40 minút.

· RevTaq RT-PCR DNA polymeráza umožňuje vysokoteplotnú reverznú transkripciu priamo z RNA templátu a krok reverznej transkripcie možno opakovať viackrát, aby sa vytvorilo viac cDNA templátov.

· RevTaq RT-PCR DNA polymeráza umožňuje „nulový krok“ RT-PCR (žiadny krok izotermickej reverznej transkripcie), pretože v kroku predlžovania cyklickej PCR prebieha reverzná transkripcia a amplifikácia DNA súčasne.To tiež podporuje reakciu reverznej transkripcie pri vysokých teplotách, čím sa minimalizujú problémy, s ktorými sa stretávame pri tavení silnej sekundárnej štruktúry v RNA pri vysokých teplotách.

· Vďaka vzorcu horúceho štartu na báze aptaméru bude RevTaq RT-PCR DNA polymeráza produkovať lepšie výsledky, keď je teplota žíhania a predlžovania vyššia ako 57 °C.

· Keďže enzým je odolný voči teplu, odporúča sa navrhovať primery a sondy s veľmi vysokými bodmi topenia (>60°C).

· Odporúča sa optimalizovať teplotu kroku žíhania/predlžovania pomocou teplotného gradientu počas procesu nastavovania reakcie.

· Čím vyššia je teplota, tým vyššia je špecifickosť PCR.Cyklus reverznej transkripcie sa zvyčajne uskutočňuje pri vyššej teplote ako cyklus PCR, pretože hybridizácia DNA Primer:RNA Template má zvyčajne vyššiu teplotu topenia ako duplex DNA Primer:cDNA Template.

· RevTaq RT-PCR DNA polymeráza je geneticky upravená a optimalizovaná a veľkosť amplikónu je medzi 60-300 bp.

Limit detekcie DNA polymerázy RevTaq RT-PCR dosahuje 4 kópie/

Optimalizovaný reakčný systém (založenie primerov s vysokou teplotou topenia) je znázornený na obrázku.RevTaq RT-PCR RT-PCR riadená DNA polymerázou vykazuje lepšiu citlivosť ako základná zmes TaqPath 1-kroková RT-qPCR a nižší gradient riedenia vzorky.

Ďalšie výhody:

Funkcia rýchleho spustenia → Počiatočný krok tepelnej denaturácie je možné preskočiť.

Vzorec aptaméru s horúcim štartom → Zabezpečte okamžite 100% aktivitu enzýmu a zabráňte nešpecifickej amplifikácii pri nízkych teplotách (<57°C).

Funkcia štiepenia → Krok extrakcie RNA je vynechaný, pretože RevTaq RT-PCR DNA polymeráza dokáže spracovať aj surové reakčné vzorky.Dokáže okamžite zničiť bunkové membrány eukaryotov, baktérií a vírusov v horúcom cykle RT-PCR.

IVD úroveň surovín → vysoký štandard kvality a mimoriadne konkurencieschopné ceny