Nedávno som objavil niečo úžasné!Mnoho pokročilých experimentálnych odborníkov v jeho okolí ani nepozná niektoré úplne základné experimentálne poznatky.

Môžete napríklad odpovedať na nasledujúce otázky?

Je rozdiel medzi OD260 a A260?Čo každý znamená?
OD je skratka optickej hustoty (optická hustota), A je skratka absorbancie (absorbancia), dva pojmy sú v skutočnosti rovnaké, „optická hustota“ je „absorbancia“, ale „optická hustota“ je v súlade s väčšinou národných noriem a je štandardizovanejšia.

Zvyčajne meriame hodnotu OD pri 260 nm, aby sme vypočítali koncentráciu nukleovej kyseliny, čo teda predstavuje 1OD?
Nukleová kyselina má maximálny absorpčný vrchol pri vlnovej dĺžke 260 nm, ktorá obsahuje DNA aj RNA, ako aj fragmentované fragmenty nukleových kyselín (toto je kľúčový bod).
Hodnota OD nameraná pri vlnovej dĺžke 260 nm bola zaznamenaná ako OD260.Ak je vzorka čistá, hodnota OD260 môže vypočítať koncentráciu vzorky nukleovej kyseliny.
1 OD260 = 50 μg/ml dsDNA (dvojvláknová DNA)
=37 μg/ml ssDNA (jednovláknová DNA)
= 40 ug/ml RNA
= 30 μg/ml dNTP (oligonukleotidy)
Existuje nejaké spojenie a rozdiel medzi RT-PCR, Realtime-PCR a QPCR?
RT-PCR je skratka pre Reverse Transscription PCR
Real Time PCR=qPCR, skratka pre Quantitative Real Time PCR
Aj keď sa zdá, že PCR v reálnom čase (fluorescenčná kvantitatívna PCR v reálnom čase) a PCR s reverznou transkripciou (reverzná transkripčná PCR) sú skrátené ako RT-PCR.Ale medzinárodná konvencia je: RT-PCR špecificky odkazuje na PCR s reverznou transkripciou.

Aké sú bežne používané nt, bp a kb na opis dĺžky DNA/RNA v biológii?
nt = nukleotid
bp = pár báz bázový pár
kb = kilobáza

Samozrejme, povedali by ste, že mnohým na týchto malých detailoch nezáleží!Každý to robí a nikto sa vás nebude pýtať, čo to je.Vieš, že je to zbytočné, však?

Nie, nie, nie, toto je veľmi potrebné vedieť!kvôli čomu?
Pretože chcete uverejniť článok!Brat!Či už sa chystáte na promóciu alebo sa snažíte o úspechy vo vedeckom výskume, musíte sa spoľahnúť na to, že budete hovoriť!

Extrakcia nukleových kyselín by mala byť najjednoduchším a najzákladnejším experimentom.Kvalita extrakcie nukleových kyselín priamo určuje výsledky následných experimentov.

Aj keď som to už veľakrát povedal, stále je veľa priateľov, ktorým je to jedno.Tentokrát som sa rozhodol odsťahovať z článku!

Minimálne informácie pre publikovanie kvantitatívnych real-time PCR experimentov, označovaných ako MIQE, je súbor usmernení pre fluorescenčné kvantitatívne experimenty spustených medzinárodne, ktorý navrhuje minimálne štandardy pre experimentálne informácie potrebné na vyhodnotenie fluorescenčných kvantitatívnych PCR experimentov a publikovanie článkov.Prostredníctvom experimentálnych podmienok a metód analýzy poskytnutých experimentátorom môžu recenzenti lepšie vyhodnotiť platnosť výskumnej experimentálnej schémy.

Je možné vidieť, že v sekcii extrakcie nukleových kyselín boli navrhnuté nasledujúce detekčné položky:

„E“ označuje informácie, ktoré sa musia poskytnúť, a „D“ označuje informácie, ktoré by sa mali poskytnúť v prípade potreby.

Forma je veľmi komplikovaná, v skutočnosti chcem povedať, že každý musí začať od

čistota (D), výťažok (D), integrita (E) a konzistencia (E) na vyhodnotenie nukleových kyselín v týchto štyroch aspektoch.

Podľa experimentálnych zvyklostí najprv hovorte o metódach hodnotenia čistoty a koncentrácie.

Meranie OD je obľúbenou a najjednoduchšou metódou detekcie pre experimentátorov.Čo sa týka princípu, nebudem sa tu rozpisovať.Mnoho laboratórií teraz používa ultra-mikro spektrofotometre na priamu kvantitatívnu analýzu vzoriek nukleových kyselín.Počas zobrazenia hodnoty absorbancie program priamo udáva hodnotu koncentrácie (nukleová kyselina, proteín a fluorescenčné farbivo) a súvisiace pomery.Pokiaľ ide o analýzu hodnoty OD, uložte tento obrázok a budete v poriadku.

Univerzálny zoznam riešení s hodnotou OD

Existuje však niekoľko upozornení, ktoré je potrebné uviesť samostatne.

(Napokon viem, že vy musíte byť tí, ktorí šetria a čakajú, kým ich budete potrebovať!)

Poznámka 1 Zariadenie

Hodnota OD bude ovplyvnená rôznymi zariadeniami.Pokiaľ je OD260 v určitom rozsahu, hodnoty OD230 a OD280 majú zmysel.Napríklad rozsah absorbancie bežného Eppendorf D30 pri 260 nm je 0 až 3 A a NanoDrop One od Thermo je pri 260 nm.Rozsah absorbancie 0,5~62,5A.

Poznámka 2Zrieďovacie činidlo

Hodnota OD môže byť ovplyvnená riedením rôznych činidiel.Napríklad odčítanie OD260/280 purifikovanej RNA v pH7,5 10 mM Trisbuffer je medzi 1,9-2,1, kým vneutrálny vodný roztokpomer bude nižší, možno len 1,8-2,0, ale to neznamená, že sa kvalita RNA mení Rozdiel.

Poznámka 3Zvyškové látky

Existencia reziduálnych látok ovplyvní presnosť merania koncentrácie nukleových kyselín, preto je potrebné sa čo najviac vyhýbať proteínovým, fenolovým, polysacharidovým a polyfenolovým zvyškom vo vzorkách nukleových kyselín.

V skutočnosti je však extrakcia organickými činidlami stará metóda.V komerčných súpravách možno extrakčný efekt dosiahnuť pomocou adsorpčnej kolóny na báze oxidu kremičitého kombinovanou s odstreďovaním, vyhýbajúc sa toxickým a škodlivým organickým činidlám, ktoré sa ťažko odstraňujú atď. Problém, ako napr.Súprava na extrakciu nukleových kyselín od Foregene, nepoužíva DNázu/RNázu a toxické organické činidlá počas operácie, rýchla a bezpečná, aúčinok jedobre(náhodou povedal, že to bol plešatý, ale viem, že to chceš vedieť).

Príklad 1: Výťažok a čistota extrakcie genómovej DNA

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) spracováva vzorky pôdy z rôznych zdrojov a množstvo a čistota získanej genómovej DNA sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
Príklad 2: Výťažok a čistota extrakcie tkanivovej RNA

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) spracovala rôzne vzorky tkaniva a množstvo a čistota získanej RNA sú uvedené v tabuľke nižšie (pre myšacie tkanivo):
Nemyslite si však, že ste s hodnotou OD skončili.Máte nejakú starostlivosť o kľúčové body, ktoré som vám nakreslil vpredu?

Všimnite si

V absorbancii sa vypočítajú aj molekuly fragmentovaných nukleových kyselín.Za predpokladu, že máte v RNA zvyšky genómovej DNA, vaša hodnota OD sa bude zdať veľmi vysoká, ale skutočnú koncentráciu RNA nemožno určiť.Či je vaša RNA Nie je jasné, či dochádza k degradácii, takže stále potrebujeme komplexnú metódu hodnotenia, aby sme poskytli presnejší úsudok, to znamená hodnotenie integrity nukleovej kyseliny uvedené v MIQE.