• Facebook
  • linkedin
  • YouTube

Ako nový v laboratóriu nie je dobrou úlohou vytriediť pozitívne rastliny zo skupiny rastlín s nízkou mierou konverzie.Po prvé, DNA sa musí extrahovať z veľkého počtu vzoriek jeden po druhom a potom sa cudzie gény detegujú pomocou PCR.Výsledkom sú však často prázdne miesta a pásy s niekoľkými položkami, ale nie je možné určiť, či ide o zmeškané alebo nesprávne zistenia..Je veľmi bezmocné čeliť takémuto experimentálnemu procesu a výsledkom?Nebojte sa, brat vás naučí, ako jednoducho a presne odstrániť transgénne pozitívne rastliny.

Krok 1

Navrhnite detekčné priméry

Rapid1

Určte endogénny gén a exogénny gén, ktorý sa má detegovať, podľa testovanej vzorky a vyberte reprezentatívnu 100-500 bp sekvenciu v géne pre návrh priméru.Dobré primery môžu zabezpečiť presnosť výsledkov detekcie a skrátiť čas detekcie (bežne používané detekčné primery nájdete v prílohe).

Upozornenie: Novo navrhnuté priméry musia optimalizovať reakčné podmienky a overiť presnosť, presnosť a detekčný limit detekcie pred detekciou vo veľkom meradle.

Krok 2

Navrhnite experimentálny protokol

Rapid2

Pozitívna kontrola: Použite purifikovanú DNA obsahujúcu cieľový fragment ako templát na určenie, či sú reakčný systém a podmienky PCR normálne.

Negatívna/slepá kontrola: Použite šablónu DNA alebo ddH2O, ktorá neobsahuje cieľový fragment, ako šablónu na zistenie, či v systéme PCR existuje zdroj kontaminácie.

Vnútorná referenčná kontrola: použite kombináciu primér/sonda endogénneho génu vzorky, ktorá sa má testovať, na vyhodnotenie, či možno templát detegovať pomocou PCR.

Upozornenie:

Pre každý test by sa mali nastaviť pozitívne, negatívne/slepé kontroly a kontroly vnútornej kontroly, aby sa vyhodnotila platnosť experimentálnych výsledkov.

Príprava experimentu

Rapid3

Pred použitím skontrolujte, či je roztok rovnomerne premiešaný.Ak sa zistí zrazenina, je potrebné ju pred použitím rozpustiť a zmiešať podľa návodu.2×PCR zmes je potrebné pred použitím napipetovať a opakovane premiešať mikropipetou, aby sa predišlo nerovnomernej distribúcii iónov.

Upozornenie:

Vytiahnite návod a pozorne si ho prečítajte a pred experimentom sa pripravte v prísnom súlade s požiadavkami návodu.

Krok 4

Pripravte reakčný systém PCR

Rapid4

Podľa experimentálneho protokolu rovnomerne premiešajte primery, H2O a 2×PCR, odstreďte a rozdeľte do každej reakčnej skúmavky.

Upozornenie:

Na rozsiahle alebo dlhodobé testovanie sa odporúča použiť reakčný systém PCR obsahujúci enzým UNG, ktorý dokáže účinne zabrániť kontaminácii aerosólom spôsobenej produktmi PCR.

Krok 5

Pridajte šablónu reakcie

Rapid5

Pri použití technológie Direct PCR nie je potrebný zdĺhavý proces purifikácie nukleových kyselín, templát vzorky možno pripraviť do 10 minút a možno pridať zodpovedajúci reakčný systém PCR.

Upozornenie:

Metóda štiepenia má lepší detekčný účinok a získaný produkt je možné použiť na viaceré detekčné reakcie.

Rapid6

5.1: Priama expanzia listov

Podľa veľkosti obrázku v návode odrežte listové pletivo s priemerom 2-3mm a vložte do reakčného systému PCR.

Poznámka: Uistite sa, že úlomky listov sú úplne ponorené do reakčného roztoku PCR a nepridávajte nadmerné tkanivo listov.

5.2: Metóda rozdelenia listov

Odrežte listové pletivo s priemerom 5-7 mm a vložte ho do centrifugačnej skúmavky.Ak si vyberiete zrelé listy, vyhnite sa použitiu pletív hlavnej žilky listu.Napipetujte 50 ul lyzátu pufra P1 do centrifugačnej skúmavky, aby ste sa uistili, že lyzát môže úplne ponoriť tkanivo listov, umiestnite ho do termocykléra alebo kovového kúpeľa a lýzujte pri 95 °C počas 5-10 minút.

Rapid7

Pridajte 50 ul neutralizačného roztoku pufra P2 a dobre premiešajte.Výsledný lyzát môže byť použitý ako templát a pridaný do PCR reakčného systému.

Poznámka: Množstvo templátu je medzi 5 – 10 % systému PCR a nemalo by presiahnuť 20 % (napríklad v systéme 20 μl PCR pridajte 1 – 2 μl lyzačného roztoku, nie viac ako 4 μl).

Krok 6

PCR reakcia

Rapid8

Po odstredení PCR reakčnej skúmavky sa táto umiestni do PCR prístroja na amplifikáciu.

Upozornenie:

Reakcia využíva na amplifikáciu nepurifikovaný templát, takže počet amplifikačných cyklov je o 5-10 cyklov viac ako pri použití purifikovaného templátu DNA.

Krok 7

Elektroforéza detekcia a analýza výsledkov

Rapid9

M: 100bp DNA rebrík

1\4: Metóda purifikovanej DNA

2\5: Priama metóda PCR

3\6: Prázdny ovládací prvok

QC:

Výsledky testov rôznych kontrol nastavených v experimente by mali spĺňať nasledujúce podmienky.V opačnom prípade by sa mala analyzovať príčina problému a po odstránení problému by sa mal test vykonať znova.

Tabuľka 1. Normálne výsledky testov rôznych kontrolných skupín

*Keď sa plazmid použije ako pozitívna kontrola, výsledok testu endogénneho génu môže byť negatívny

Výsledok rozsudku:

Odpoveď: Výsledok testu endogénneho génu vzorky je negatívny, čo naznačuje, že DNA vhodnú na bežnú detekciu PCR nemožno zo vzorky extrahovať alebo extrahovaná DNA obsahuje inhibítory reakcie PCR a DNA by sa mala extrahovať znova.

B. Výsledok testu endogénneho génu vzorky je pozitívny a výsledok testu exogénneho génu je negatívny, čo naznačuje, že zo vzorky sa extrahuje DNA vhodná na bežnú PCR detekciu a možno usúdiť, že gén XXX sa vo vzorke nezistil.

C. Výsledok testu endogénneho génu vzorky je pozitívny a výsledok testu exogénneho génu je pozitívny, čo naznačuje, že DNA vhodná na bežnú detekciu PCR bola extrahovaná zo vzorky a DNA vzorky obsahuje gén XXX.Potvrdzovacie experimenty sa môžu vykonávať ďalej.

Krok 8

Navrhnite detekčné priméry

Rýchla 10

Po experimente použite 2% roztok chlórnanu sodného a 70% roztok etanolu na utretie experimentálnej oblasti, aby ste zabránili znečisteniu životného prostredia.


Čas odoslania: september-08-2021