Špecifickosť detekcie

Vo väčšine prípadov je účelom návrhu primeru maximalizovať špecifickosť PCR.To je určené viac či menej predvídateľným vplyvom mnohých premenných.Jednou dôležitou premennou je sekvencia na 3' konci priméru.

Dôležité je, že PCR testy navrhnuté pre špecifickosť si s väčšou pravdepodobnosťou udržia vysokú účinnosť v širokom dynamickom rozsahu, pretože test neprodukuje nešpecifické amplifikačné produkty, čím konkuruje PCR činidlám alebo inhibuje hlavnú amplifikačnú reakciu.

Samozrejme, v niektorých prípadoch nie je špecifickosť najdôležitejšia, napríklad keď je cieľom kvantifikovať úzko súvisiace, ale odlišné patogény, vyžadujú sa špeciálne štandardy pre návrh, optimalizáciu a overovanie.

Krivka topenia je štandardná metóda na hodnotenie špecifickosti amplikónov, aspoň pokiaľ ide o to, či sa má amplifikovať jeden cieľ.Je však potrebné zdôrazniť, že krivky topenia môžu byť zavádzajúce, pretože môžu byť napríklad ovplyvnené kombinovanými účinkami suboptimálnych primerov a nízkych koncentrácií templátu.

P5 |Krivka topenia ukazuje posuny Tm získané z dvoch detekcií rôznych množstiev dvoch cieľových DNA.

A. Pri vyšších koncentráciách (ad) nie je po dokončení merania qPCR zjavný žiadny dimér primeru.Keď sa koncentrácia templátu zníži na 50 kópií (e), začne sa objavovať nešpecifický produkt a stane sa jediným produktom s najnižšou koncentráciou (f).

B. Test zaznamenal rovnaké Tms pri všetkých cieľových koncentráciách a ani pri najnižšej koncentrácii (5 kópií) nebol zrejmý žiadny primérový dimér.Pri použití týchto dvoch detekčných metód sa v NTC nezistili žiadne amplifikačné produkty.

P5 ukazuje krivky rozpúšťania získané so vzorkami, v ktorých je templát prítomný v rôznych koncentráciách.P 5a ukazuje, že pri dvoch najnižších koncentráciách sú Tms produkovaných nešpecifických amplifikačných produktov nižšie ako Tms špecifických amplikónov.

Je zrejmé, že túto metódu detekcie nemožno spoľahlivo použiť na detekciu cieľov, ktoré existujú v nízkych koncentráciách.

Je zaujímavé, že NTC, tj vzorky bez akejkoľvek DNA, nezaznamenali (nešpecifické) amplifikačné produkty, čo naznačuje, že pozadie genómovej DNA sa môže zúčastniť na nešpecifickej amplifikácii/polymerizácii.

Niekedy sa takéto priméry pozadia a nešpecifická amplifikácia nedajú napraviť, ale často je možné navrhnúť metódu detekcie, ktorá nemá nešpecifickú amplifikáciu v žiadnej templátovej koncentrácii a NTC (P 5b).

Tu dokonca zaznamenanie amplifikácie cieľovej koncentrácie s Cq 35 vytvorí špecifickú krivku rozpúšťania.Podobne NTC nevykazovali žiadne známky nešpecifickej amplifikácie.Niekedy môže byť detekčné správanie závislé od materského lúhu a v určitých tlmivých zloženiach sa deteguje len nešpecifická amplifikácia, ktorá môže súvisieť s rôznymi koncentráciami Mg2+.

Stabilita detekcie

Optimalizácia Ta je užitočným krokom v empirickom overovacom a optimalizačnom procese detekcie qPCR.Poskytuje priamu indikáciu robustnosti súpravy primérov zobrazením teploty (alebo teplotného rozsahu), ktorá produkuje najnižšie Cq bez zosilnenia NTC.

Dvoj- až štvornásobný rozdiel v citlivosti nemusí byť dôležitý pre ľudí s vysokou expresiou mRNA, ale pre diagnostické testy môže znamenať rozdiel medzi pozitívnymi a falošne negatívnymi výsledkami.

Vlastnosti Ta primérov qPCR sa môžu značne líšiť.Niektoré testy nie sú veľmi robustné a ak sa nevykonávajú pri optimálnej hodnote Ta primérov, rýchlo sa zrútia.

Je to dôležité, pretože tento typ detekcie je v reálnom svete často problematický a čistota vzorky, koncentrácia DNA alebo prítomnosť inej DNA nemusia byť optimálne.

Okrem toho sa cieľový počet kópií môže líšiť v širokom rozsahu a činidlá, plastové náčinie alebo nástroje sa môžu líšiť od tých, ktoré sa používajú pri nastavovaní testu.

P6|Teplotný gradient ukazuje rôznu robustnosť detekcie PCR.

A. Použite Bioline's Sensifast SYBR mastermix (katalógové číslo BIO-98050) na vykonanie PCR na cDNA pripravenej z RNA ľudského mozgu.

B. Na zaznamenanie amplifikačnej mapy a krivky rozpúšťania apalénu použite prístroj Bio-Rad CFX qPCR (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. Graf amplifikácie a krivka topenia ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Graf amplifikácie a krivka rozpúšťania GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs zaznamenané pri rôznych teplotách žíhania, ukazujúce rozdiel v Cq zaznamenanom pri teplotnom gradiente 7C.

P 6 ukazuje typický výsledok nežiaduceho testu, kde sa qPCR uskutočnila s použitím gradientu Tas medzi 59C a 67C (P 6a), s použitím primérov pre tri gény špecifické pre ľudský mozog.

Z grafu amplifikácie je možné vidieť, že priméry Opalín nie sú ani zďaleka ideálne, pretože ich optimálny rozsah Ta je veľmi úzky (obrázok 6b), to znamená, že Cq sú široko rozptýlené, čo vedie k tomu, že Cq sú výrazne v porovnaní s ich optimálnym Cqs Low.

Táto metóda detekcie je nestabilná a môže viesť k suboptimálnej amplifikácii.Preto by sa tento pár primerov mal prepracovať.Okrem toho analýza krivky topenia (vložený obrázok) ukazuje, že špecifickosť tejto detekčnej metódy môže byť tiež problematická, pretože krivka topenia každého Ta je odlišná.

Metóda detekcie ACSBG1 uvedená v P 6c je robustnejšia ako metóda detekcie Opalin vyššie, ale stále je ďaleko od ideálu a je pravdepodobné, že ju možno zlepšiť.

Zdôrazňujeme však, že neexistuje žiadna nevyhnutná súvislosť medzi robustnosťou a špecifickosťou, pretože krivka rozpúšťania vytvorená touto detekčnou metódou ukazuje rovnakú maximálnu hodnotu vo všetkých Tas (vložka).

Na druhej strane je test robustnosti oveľa tolerantnejší a produkuje podobné Cq v širokom rozsahu Tas, ako v teste GFAP znázornenom v P 6d.

Rozdiel v Cqs získaných v rovnakom rozsahu 8 stupňov Celzia je menší ako 1 a krivka rozpúšťania (vložka) potvrdzuje detekčné charakteristiky v tomto teplotnom rozsahu.Stojí za zmienku, že vypočítaný Tas a skutočný rozsah Ta sa môžu veľmi líšiť.

Existuje mnoho usmernení určených na pomoc výskumníkom pri navrhovaní účinných primérov, z ktorých väčšina je založená na dlhodobo zavedených pravidlách a veľká pozornosť sa venovala 3′koncu primérov.Často sa odporúča zahrnúť G alebo C na 3' konci a dve G alebo C bázy (GC svorka), ale nie viac ako dve z posledných 5 báz.

V praxi môžu tieto pravidlá viesť výskumníkov, ale nemusia byť za každých okolností správne.

P7 |3' koniec priméru má malý vplyv na špecifickosť alebo účinnosť.

A. Poloha primérov pre ľudský HIF-la (NM_181054.2) gén.

B. Použite Agilent Brilliant III SYBR Green matečný lúh (kat. č. 600882) na amplifikáciu šiestich testovaných položiek.

C. Graf amplifikácie a krivka topenia zaznamenaná prístrojom Bio-Rad CFX qPCR a 3'-koncovými primérmi.NTC sú zobrazené červenou farbou.

D. Cqs záznam každej testovanej položky

Napríklad výsledok v P 7 odporuje pravidlu 3′konca.Všetky návrhy poskytujú v podstate rovnaké výsledky, pričom iba dve kombinácie primérov vedú k nešpecifickej amplifikácii v NTC.

Nemôžeme však podporiť účinok GC klipu, pretože v tomto prípade použitie A alebo T ako maximálne 30 báz neznižuje špecifickosť.

Test C, kde F primér končí v GGCC, zaznamenal Cqs v NTC, čo naznačuje, že by sme sa mohli chcieť vyhnúť týmto sekvenciám na 30-konci.Zdôrazňujeme, že jediný spôsob, ako určiť najlepšiu 3'koncovú sekvenciu páru primérov, je experimentálne vyhodnotiť niektoré kandidátske priméry.

Účinnosť zosilnenia

Dôležité je, že aj keď sa nešpecifická PCR detekcia nikdy nemôže stať špecifickou, účinnosť amplifikácie môže byť upravená a maximalizovaná mnohými rôznymi spôsobmi zmenou enzýmu, materského lúhu, aditív a podmienok cyklovania.

Na vyhodnotenie účinnosti detekcie PCR je najlepšie použiť sériové riedenie 10- alebo 5-násobku cieľovej nukleovej kyseliny, to znamená „metóda štandardnej krivky“.

Ak sa na vytvorenie štandardnej krivky používajú amplikóny PCR alebo syntetické ciele DNA, sériové riedenia týchto cieľov by sa mali zmiešať s konštantným množstvom základnej DNA (ako je genómová DNA).

P8 |Krivka riedenia na vyhodnotenie účinnosti PCR.

A. Použite primery pre HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA a R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC a Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalógové číslo 600882) pre podmienky PCR a krivky topenia.

B. 100 ng RNA bolo reverzne transkribované, nariedené 2-krát a sériovo zriedené vzorky cDNA boli nariedené 5-krát na 1 ng ľudskej genómovej DNA.Krivka topenia je znázornená v prílohe.

C. RT reakcia, riedenie a sériové riedenie sa opakovali pre druhú vzorku cDNA a výsledky boli podobné.

P 8 ukazuje dve štandardné krivky s použitím rovnakej detekčnej metódy na dvoch rôznych vzorkách cDNA, výsledkom je rovnaká účinnosť, približne 100 %, a podobná je aj hodnota R2, teda stupeň zhody medzi experimentálnymi údajmi a regresnou čiarou alebo údaj Stupeň linearity.

Tieto dve štandardné krivky sú porovnateľné, ale nie úplne rovnaké.Ak je cieľom presne kvantifikovať cieľ, je potrebné poznamenať, že je neprijateľné poskytnúť výpočet počtu kópií bez vysvetlenia neistoty.

P9 |Neistota merania spojená s kvantifikáciou pomocou štandardnej krivky.

A. Na uskutočnenie podmienok PCR a krivky topenia použite priméry pre GAPDH (NM_002046).F: ACAGTTGCCATGTAGACC a R: TAACTGGTTGAGCACAGG a Mastermix Sensifast SYBR od Bioline (katalógové číslo BIO-98050).

B. Graf amplifikácie, krivka topenia a štandardná krivka zaznamenané prístrojom Bio-Rad CFX qPCR.

C. Graf štandardnej krivky a 95 % interval spoľahlivosti (CI).

D. Počet kópií a 95 % interval spoľahlivosti troch hodnôt Cq odvodených z krivky riedenia.

P 9 ukazuje, že pre optimalizovaný test je inherentná variabilita jednej štandardnej krivky približne 2-násobná (95 % interval spoľahlivosti, minimum až maximum), čo môže byť najmenšia variabilita, ktorú možno očakávať.

Súvisiaci produkt:

Súprava Cell Direct RT qPCR

Súprava Mouse Tail Direct PCR

Súprava Animal Tissue Direct PCR