PCR je najpoužívanejšia technológia amplifikácie nukleových kyselín a je široko používaná vďaka svojej citlivosti a špecifickosti.PCR však vyžaduje opakovanú tepelnú denaturáciu a nemôže sa zbaviť obmedzení spoliehania sa na nástroje a vybavenie, čo obmedzuje jej použitie pri testovaní v klinickom teréne.

Od začiatku 90. rokov minulého storočia mnohé laboratóriá začali vyvíjať technológiu zosilňovania konštantnej teploty, ktorá nevyžaduje tepelnú denaturáciu.Teraz vyvinuli technológiu izotermickej amplifikácie sprostredkovanej slučkou, technológiu izotermickej amplifikácie nahradenia vlákna, technológiu izotermickej amplifikácie s rotujúcim kruhom a závislosť sekvencie nukleových kyselín.Technológia izotermického zosilnenia a iné technológie. 

Lizotermické zosilnenie sprostredkované oopom

Princíp amplifikácie je založený na skutočnosti, že DNA je v dynamickom rovnovážnom stave pri teplote približne 65 °C.Keď sa ktorýkoľvek primér spáruje s bázami a predĺži sa na komplementárnu časť dvojvláknovej DNA, druhé vlákno sa disociuje a stane sa jednovláknovým.

Pri tejto teplote DNA používa 4 špecifické priméry, aby sa spoliehala na DNA polymerázu s vytesnením vlákna, aby sa syntéza DNA s vytesnením vlákna mohla nepretržite pohybovať.

Najprv určte 6 špecifických oblastí F3, F2, F1, B1, B2, B3 na cieľovom géne a potom navrhnite 4 priméry založené na týchto 6 špecifických oblastiach (ako je znázornené na obrázku nižšie):

Dopredný vnútorný primér (FIP) sa skladá z F1c a F2.

Zadný vnútorný primér (BIP) sa skladá z B1c a B2 a TTTT sa používa ako rozpera v strede.

Vonkajšie priméry F3 a B3 sa skladajú z oblastí F3 a B3 na cieľovom géne.

V reakčnom systéme LAMP je koncentrácia vnútorného primeru niekoľkonásobkom koncentrácie vonkajšieho primeru.Vnútorný primér sa najskôr spojí s templátovým reťazcom, aby sa syntetizovalo komplementárne vlákno za vzniku dvojvlákna DNA.Následne sa vonkajší primér spojí s templátovým reťazcom za vzniku dvojvlákna DNA.Pôsobením BstDNA polymerázy sa uvoľní komplementárne vlákno syntetizované vnútorným primerom.Po sérii reakcií komplementárne vlákno nakoniec vytvorí jedno vlákno DNA s činkovou štruktúrou.

Samotný jednovláknový reťazec DNA s činkovou štruktúrou sa používa ako templát na kontinuálne vytváranie prechodnej DNA so štruktúrou stonky a slučky s otvoreným koncom.Vnútorné a vonkajšie priméry vedú prechodnú DNA so štruktúrou vlásenky so slučkou tak, aby nepretržite podliehala reakciám premiestňovania a predlžovania reťazca a nakoniec vytvárala viacero štruktúr vlásenka-slučka s rôznymi dĺžkami.Zmes DNA.

Výhody a nevýhody izotermického zosilnenia sprostredkovaného slučkou

Výhody LAMP:

(1) Vysoká účinnosť amplifikácie, ktorá môže účinne amplifikovať 1-10 kópií cieľového génu v priebehu 1 hodiny, a účinnosť amplifikácie je 10-100-krát vyššia ako pri bežnej PCR.

(2) Reakčný čas je krátky, špecifickosť je silná a nie je potrebné žiadne špeciálne vybavenie.

Nedostatky LAMP:

(1) Požiadavky na základné nátery sú obzvlášť vysoké.

(2) Amplifikovaný produkt nemožno použiť na klonovanie a sekvenovanie, ale možno ho použiť iba na posúdenie.

(3) Vďaka svojej vysokej citlivosti je ľahké vytvárať aerosóly, ktoré spôsobujú falošné pozitívne výsledky a ovplyvňujú výsledky testu.

Szosilnenie posunu trandu

Strand displacement amplification (SDA) je in vitro izotermická DNA amplifikačná technika založená na enzymatickej reakcii, ktorú prvýkrát navrhol americký vedec Walker v roku 1992.

Základný systém SDA zahŕňa reštrikčnú endonukleázu, DNA polymerázu s aktivitou vytesňovania vlákna, dva páry primérov, dNTP a vápenaté a horečnaté ióny a pufrovacie systémy.

Princíp amplifikácie s vytesnením vlákna je založený na chemicky modifikovanej rozpoznávacej sekvencii reštrikčnej endonukleázy na oboch koncoch cieľovej DNA.Endonukleáza otvorí medzeru vo vlákne DNA v jej rozpoznávacom mieste a DNA polymeráza predĺži medzeru na 3' konci a nahradí ďalší reťazec DNA.

Nahradené jednoduché vlákna DNA môžu byť kombinované s primérmi a predĺžené na dvojité vlákna pomocou DNA polymerázy.Tento proces sa kontinuálne opakuje, takže cieľová sekvencia je efektívne amplifikovaná.

Výhody a nevýhody technológie zosilnenia posunu vlákna

Výhody SDA:

Účinnosť zosilnenia je vysoká, reakčný čas je krátky, špecifickosť je silná a nie je potrebné žiadne špeciálne vybavenie.

Nevýhody SDA:

Produkty nie sú jednotné a niektoré jednovláknové a dvojvláknové produkty sa vždy vyrábajú v cykle SDA a pri detekcii elektroforézou nevyhnutne dôjde k chvostovaniu.

Rzosilnenie ollingovho kruhu

Amplifikácia rotujúceho kruhu (RCA) je navrhnutá na základe metódy kopírovania DNA z patogénnych organizmov pomocou rotujúceho kruhu.Vzťahuje sa na použitie jednovláknovej kruhovej DNA ako templátu pri konštantnej teplote a špeciálnej DNA polymerázy (ako je Phi29) ) Pod pôsobením syntézy DNA s rotujúcim kruhom na dosiahnutie amplifikácie cieľového génu.

RCA možno rozdeliť na lineárne zosilnenie a exponenciálne zosilnenie.Účinnosť lineárneho RCA môže dosiahnuť 10⁵krát a účinnosť exponenciálneho RCA môže dosiahnuť 10⁹krát.

Jednoduché rozlíšenie, ako je znázornené na obrázku nižšie, lineárna amplifikácia a používa iba 1 primér, exponenciálna amplifikácia b má 2 priméry.

Lineárna RCA sa tiež nazýva RCA s jedným primérom.Primér sa viaže na kruhovú DNA a predlžuje sa pôsobením DNA polymerázy.Produkt je lineárny jednovláknový reťazec s veľkým počtom opakujúcich sa sekvencií tisíckrát dlhších ako jedna slučka.

Pretože produkt lineárneho RCA je vždy pripojený k štartovaciemu priméru, ľahká fixácia signálu je hlavnou výhodou.

Exponenciálna RCA, tiež známa ako Hyper vetvená amplifikácia HRCA (Hyper vetvená RCA), pri exponenciálnej RCA jeden primér amplifikuje produkt RCA, druhý primér hybridizuje s produktom RCA a predlžuje sa a náhrada je už naviazaná na produkt RCA. Priméry po prúde predlžujú reťazec a opakujú predlžovanie a nahradzovanie, aby sa vytvoril denmplifikačný produkt RCA a.

Výhody a nevýhody amplifikácie nukleovej kyseliny s rotujúcim kruhom

Výhody RCA:

Vysoká citlivosť, dobrá špecifickosť a jednoduchá obsluha.

Nedostatky RCA:

Problémy na pozadí počas detekcie signálu.Počas RCA reakcie môže necirkulovaná sonda visiaceho zámku a templátová DNA alebo RNA nenaviazanej sondy generovať určité signály pozadia. 

Namplifikácia založená na sekvencii kyseliny ukleovej

Amplifikácia založená na sekvencii nukleových kyselín (NASBA) je nová technológia vyvinutá na báze PCR.Ide o kontinuálnu a izotermickú amplifikáciu nukleovej kyseliny riadenú párom primérov so sekvenciou promótora T7.Technológia dokáže amplifikovať templátovú RNA približne 109-krát za približne 2 hodiny, čo je 1000-krát viac ako pri konvenčnej metóde PCR a nevyžaduje špeciálne vybavenie.

Táto technológia bola použitá na rýchlu diagnostiku chorôb hneď, ako sa objavili, a mnohé spoločnosti v súčasnosti používajú túto metódu v súpravách na detekciu RNA.

Hoci RNA amplifikácia môže využívať aj technológiu reverznej transkripcie PCR, NASBA má svoje výhody: môže sa vykonávať za relatívne konštantných teplotných podmienok a je stabilnejšia a presnejšia ako tradičná technológia PCR.

Reakcia prebieha pri 41 stupňoch Celzia a na dokončenie vyžaduje AMV (vírus vtáčej myeloblastózy) reverznú transkriptázu, RNázu H, T7 RNA polymerázu a pár primérov.

Proces zahŕňa najmä:

Dopredný primér obsahuje komplementárnu sekvenciu promótora T7.Počas reakcie sa priamy primér viaže na vlákno RNA a je katalyzovaný enzýmom AMV za vzniku dvojvlákna DNA-RNA.

RNáza H štiepi RNA v hybridnom dvojvláknovom reťazci a zachováva jednovláknovú DNA.

Pôsobením reverzného priméru a enzýmu AMV sa vytvorí dvojvlákno DNA obsahujúce sekvenciu promótora T7.

Pôsobením T7 RNA polymerázy sa dokončí proces transkripcie a vytvorí sa veľké množstvo cieľovej RNA.

Výhody NASBA:

(1) Jeho primér má sekvenciu promótora T7, ale cudzia dvojvláknová DNA nemá sekvenciu promótora T7 a nemôže byť amplifikovaná, takže táto technológia má vysokú špecifickosť a citlivosť.

(2) NASBA priamo začleňuje proces reverznej transkripcie do amplifikačnej reakcie, čím skracuje reakčný čas.

Nevýhody NASBA:

(1) Zložky reakcie sú komplikovanejšie.

(2) Na zvýšenie nákladov na reakciu sú potrebné tri druhy enzýmov.