• Facebook
  • linkedin
  • YouTube

 Fluorescenčná kvantitatívna PCR (tiež známa ako TaqMan PCR, ďalej označovaná ako FQ-PCR) je nová kvantitatívna technológia nukleových kyselín vyvinutá spoločnosťou PE (Perkin Elmer) v Spojených štátoch v roku 1995. Táto technológia je založená na konvenčnej PCR pridaním fluorescenčne značených sond.V porovnaní s flexibilnou PCR má FQ-PCR mnoho výhod na realizáciu svojej kvantitatívnej funkcie.Cieľom tohto článku je stručne opísať charakteristiky, princípy, metódy a aplikácie technológie.

1 Vlastnosti

FQ-PCR má nielen vysokú citlivosť bežnej PCR, ale aj vďaka použitiu fluorescenčných sond dokáže priamo detegovať zmenu fluorescenčného signálu počas amplifikácie PCR cez systém fotoelektrickej vodivosti, čím sa získajú kvantitatívne výsledky, ktoré prekonávajú mnohé nedostatky konvenčnej PCR, takže má aj vysokú špecifickosť hybridizácie DNA a vysokú presnosť spektroskopickej technológie.

Napríklad všeobecné produkty PCR je potrebné pozorovať elektroforézou na agarózovom géli a farbením etídium bromidom ultrafialovým svetlom alebo elektroforézou na polyakrylamidovom géli a farbením striebrom.Vyžaduje si to nielen množstvo nástrojov, ale vyžaduje si to aj čas a úsilie.Použité škvrny Etídium bromid je škodlivý pre ľudské telo a tieto komplikované experimentálne postupy poskytujú príležitosti na znečistenie a falošné poplachy.FQ-PCR však potrebuje počas nakladania vzorky otvoriť veko iba raz a následným procesom je operácia úplne uzavretej skúmavky, ktorá nevyžaduje následné spracovanie PCR, čím sa vyhne mnohým nevýhodám konvenčných operácií PCR.Experiment vo všeobecnosti používa termocykler ABI7100 PCR vyvinutý spoločnosťou PE.

Prístroj má nasledujúce vlastnosti: ① Široké použitie: Môže sa použiť na kvantifikáciu produktov DNA a RNA PCR, výskum génovej expresie, detekciu patogénov a optimalizáciu podmienok PCR.② Jedinečný kvantitatívny princíp: Pri použití fluorescenčne značených sond sa množstvo fluorescencie akumuluje s cyklom PCR po excitácii laserom, aby sa dosiahol účel kvantifikácie.③ Vysoká pracovná účinnosť: Vstavaný termocykler 9600 PCR, počítačom riadený 1 až 2 hodiny na dokončenie amplifikácie a kvantifikácie 96 vzoriek automaticky a synchrónne.④ Nie je potrebná gélová elektroforéza: Nie je potrebné riediť a elektroforézovať vzorku, stačí použiť špeciálnu sondu na detekciu priamo v reakčnej skúmavke.⑤ Žiadne znečistenie v potrubí: Jedinečná plne uzavretá reakčná trubica a fotoelektrický vodivý systém sú prijaté, takže sa nemusíte obávať znečistenia.⑥Výsledky sú reprodukovateľné: kvantitatívny dynamický rozsah je až päť rádov.Preto, odkedy bola táto technológia úspešne vyvinutá, bola oceňovaná mnohými vedeckými výskumníkmi a bola aplikovaná v mnohých oblastiach.

2 Princípy a metódy

Pracovným princípom FQ-PCR je použitie 5′→3′ exonukleázovej aktivity enzýmu Taq na pridanie fluorescenčne značenej sondy do reakčného systému PCR.Sonda môže špecificky hybridizovať s templátom DNA obsiahnutým v sekvencii priméru.5′koniec sondy je označený fluorescenčným emisným génom FAM (6-karboxyfluoresceín, fluorescenčný emisný vrchol pri 518 nm) a 3′koniec je označený skupinou zhášajúcou fluorescenciu TAMRA (6-karboxytetrametylrodamín, predĺžený fluorescenčný emisný pík pri 582nm sa bráni vzniku 3′probeínu a fosfatázy počas PCR). zosilnenie.Keď sonda zostane neporušená, zhášacia skupina potláča fluorescenčnú emisiu emitujúcej skupiny.Akonáhle je emitujúca skupina oddelená od zhášacej skupiny, inhibícia sa zruší a optická hustota pri 518 nm sa zvýši a je detegovaná systémom fluorescenčnej detekcie. Vo fáze renaturácie sonda hybridizuje s templátovou DNA a enzým Taq v predlžovacej fáze sa pohybuje pozdĺž templátu DNA s predlžovaním primeru.Keď sa sonda preruší, uvoľní sa zhášací efekt a uvoľní sa fluorescenčný signál.Zakaždým, keď sa šablóna skopíruje, sonda sa odreže spolu s uvoľnením fluorescenčného signálu.Pretože existuje vzťah jedna k jednej medzi počtom uvoľnených fluorofórov a počtom produktov PCR, túto techniku ​​možno použiť na presnú kvantifikáciu templátu.Experimentálny prístroj vo všeobecnosti používa termocykler ABI7100 PCR vyvinutý spoločnosťou PE a možno použiť aj iné tepelné cyklery.Ak sa na experiment použije reakčný systém typu reakcie ABI7700, po dokončení reakcie možno kvantitatívne výsledky priamo poskytnúť počítačovou analýzou.Ak používate iné termocyklery, musíte použiť fluorescenčný detektor na meranie fluorescenčného signálu v reakčnej skúmavke súčasne, aby ste vypočítali RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ predstavuje pomer intenzity luminiscencie fluorescenčnej emisnej skupiny skúmavky k intenzite luminiscencie zhášacej skupiny, RQ- predstavuje pomer dvoch v prázdnej skúmavke, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) predstavuje množstvo zmeny fluorescenčného signálu počas PCR Po spracovaní údajov je možné získať kvantitatívne výsledky.Vďaka zavedeniu fluorescenčných sond sa výrazne zlepšuje špecificita experimentu.Návrh sondy by mal vo všeobecnosti spĺňať nasledujúce podmienky: ①Dĺžka sondy by mala byť približne 20-40 báz, aby sa zabezpečila špecifickosť väzby.②Obsah GC báz je medzi 40 % a 60 %, aby sa predišlo duplikácii jednotlivých nukleotidových sekvencií.③ Vyhnite sa hybridizácii alebo prekrývaniu s primérmi.④ Stabilita väzby medzi sondou a templátom je väčšia ako stabilita väzby medzi primérom a templátom, takže hodnota Tm sondy by mala byť aspoň o 5°C vyššia ako hodnota Tm priméru.Okrem toho má na výsledky experimentu vplyv koncentrácia sondy, homológia medzi sondou a sekvenciou templátu a vzdialenosť medzi sondou a primérom.

Súvisiace produkty:

Čína Lnc-RT Heroᵀᴹ I (s gDNázou) (Super Premix pre syntézu prvého vlákna cDNA z lncRNA) Výrobca a dodávateľ |Foregene (foreivd.com)

Čína Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman výrobca a dodávateľ |Foregene (foreivd.com)


Čas odoslania: 15. októbra 2021