Predpokladom na zabezpečenie hladkého priebehu formálnych experimentov je overenie výkonu primerov a sond v počiatočnom štádiu PCR činidiel a určenie najvhodnejších reakčných podmienok.
Ako teda potrebujeme potvrdiť primérovú sondu v počiatočnom štádiu?
Hlavnými ukazovateľmi sú základná línia, krivka amplifikácie, hodnota ct, účinnosť amplifikácie, detekcia vzorky s nízkou koncentráciou, CV atď.
Základná línia
Základná čiara je horizontálna čiara v PCR amplifikačnej krivke.V prvých niekoľkých cykloch amplifikačnej reakcie PCR sa fluorescenčný signál príliš nemení a tvorí priamku.Táto priamka je základnou čiarou.
Pri skríningu primérových sond PCR venujte pozornosť tomu, či je základná línia vyrovnaná.Čistota koncentrácie primérovej sondy ovplyvní základnú líniu, napríklad spôsobí zvýšenie alebo zníženie základnej línie.Základná línia je tiež veľmi intuitívnym ukazovateľom.
Zosilňovacia krivka
Ďalším intuitívnym indikátorom je tvar krivky zosilnenia.Najlepšie je mať krivku v tvare S, aby ste sa vyhli sekundárnej amplifikácii alebo iným abnormálnym amplifikačným krivkám.
Hodnota Ct
Počet cyklov zodpovedajúcich inflexnému bodu od základnej čiary po exponenciálny rast je hodnota Ct.
Pre tú istú vzorku vedú rôzne primérové sondy k rôznym amplifikačným krivkám a zodpovedajúca hodnota Ct bude ovplyvnená účinnosťou amplifikácie a stupňom interferencie.Teoreticky, čím menšiu hodnotu Ct primérovej sondy zvolíme, tým lepšie.
Účinnosť zosilnenia
Jednou z najspoľahlivejších a najstabilnejších metód hodnotenia účinnosti amplifikácie PCR je štandardná krivka, ktorá je tiež široko uznávaná výskumníkmi.Spôsob zahŕňa vytvorenie série vzoriek na kontrolu relatívneho počtu cieľových templátov.Tieto vzorky sa zvyčajne vyrábajú sériovým riedením koncentrovaných zásobných roztokov, najčastejšie sa používa 10-násobné riedenie.Použitím série zriedených vzoriek, použitím štandardného programu qPCR na amplifikáciu na získanie hodnoty Cq a nakoniec nakreslením štandardnej krivky podľa koncentrácie každej vzorky a zodpovedajúcej hodnoty Cq na získanie lineárnej rovnice Cq= -klgX0+b a účinnosti amplifikácie E=10(-1 /k)-1.Pri použití qPCR na kvantitatívnu analýzu sa vyžaduje, aby účinnosť amplifikácie bola v rozsahu 90 % - 110 % (3,6>k>3,1).
Detekcia vzoriek s nízkou koncentráciou
Keď je koncentrácia vzorky nízka, rýchlosti detekcie rôznych primérových sond sa líšia.Vyberáme 20 vzoriek s nízkou koncentráciou na replikáciu a systém primer-sonda s najvyššou mierou detekcie je najlepší.
Variačný koeficient (CV)
10 duplicitných vzoriek možno detegovať rôznymi primérovými sondami podľa štandardu línie činidla na detekciu amplifikácie nukleovej kyseliny.
Kvantitatívne činidlá:
Presnosť
Presnosť v rámci jednej šarže by mala spĺňať: variačný koeficient (CV, %) logaritmickej hodnoty testovanej koncentrácie je ≤ 5 %.Keď je koncentrácia vzorky nízka, variačný koeficient (CV, %) logaritmu detekčnej koncentrácie je ≤ 10 %
Kvalitatívne činidlá:
Presnosť
Presnosť v rámci jednej dávky by mala spĺňať:
(1) Variačný koeficient hodnoty Ct (CV, %) ≤ 5 %
Rovnaká vzorka sa testuje paralelne 10-krát a výsledky testu by mali byť konzistentné
Čas odoslania: 18. september 2021
