V počiatočnom štádiu prepuknutia choroby je vďaka rýchlemu vývoju rýchla diagnostika podozrivých pacientov kľúčom k prevencii COVID-19.Niektoré schválené činidlá na detekciu nukleových kyselín majú krátky čas vývoja a vyskytujú sa problémy, ako je rýchle potvrdenie výkonu, nedostatočná optimalizácia činidla a veľké rozdiely medzi šaržami;Problémy rôznych klinických laboratórií v rôznych aspektoch procesu detekcie nukleových kyselín môžu tiež ovplyvniť presnosť výsledkov detekcie nukleových kyselín.Tento článok sa zameria na kľúčové prepojenia a body v súčasnej detekcii nukleových kyselín SARS-CoV-2 a analyzuje problémy falošne negatívneho a pozitívneho opätovného vyšetrenia laboratórnej detekcie nukleových kyselín a klinickej nekonzistentnosti.

Princípy detekcie nukleových kyselín SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 je RNA vírus so sekvenciou genómu približne 29 kb, s 10 génmi, ktoré môžu efektívne kódovať 10 proteínov.Vírusy sa skladajú z RNA a proteínu a vonkajšia vrstva je vonkajší obal zložený z lipidov a glykoproteínov.Vo vnútri proteínová kapsida obalí RNA do seba, čím chráni ľahko odbúrateľnú RNA (P1).

P1 Štruktúra SARS-COV-2

Vírusy napádajú bunky cez špecifické receptory na povrchu buniek, aby spôsobili infekciu, a využívajú hostiteľské bunky na replikáciu.

Princípom detekcie vírusovej nukleovej kyseliny je exponovať vírusovú RNA cez bunkový lyzát a potom použiť na detekciu fluorescenčnú reverznú transkripčnú-polymerázovú reťazovú reakciu (RT-PCR) v reálnom čase.

Kľúčom k princípu detekcie je použitie primérov a sond na dosiahnutie „cieleného párovania“ sekvencií nukleových kyselín, to znamená nájsť sekvenciu nukleových kyselín SARS-CoV-2, ktorá sa líši od iných vírusov v približne 30 000 bázach (podobnosť nukleovej kyseliny s inými vírusmi), oblasť „nízka“, navrhnúť priméry a sondy.

Priméry a sondy sú vysoko zhodné so špecifickou oblasťou nukleovej kyseliny SARS-CoV-2, to znamená, že špecifickosť je veľmi silná.Akonáhle je výsledok fluorescenčnej RT-PCR amplifikácie v reálnom čase vzorky, ktorá sa má testovať, pozitívny, dokáže, že vo vzorke je prítomný SARS-CoV-2.Pozri P2.

P2 Kroky stanovenia nukleovej kyseliny SARS-CoV-2 (fluorescenčná RT-PCR v reálnom čase)

Podmienky a požiadavky laboratória na detekciu nukleovej kyseliny SARS-CoV-2

Laboratóriá na testovanie nukleových kyselín sú najvhodnejšie pre podtlakové prostredie a mali by venovať pozornosť monitorovaniu tlaku, udržiavať prúdenie vzduchu a eliminovať aerosóly.Personál na testovanie nukleových kyselín musí mať zodpovedajúcu kvalifikáciu, musí absolvovať príslušné školenie o polymerázovej reťazovej reakcii a musí prejsť hodnotením.Laboratórium by malo byť prísne riadené, zónované a vstup irelevantného personálu by mal byť prísne zakázaný.Čistá oblasť by mala byť vetraná a dezinfikovaná na mieste.Príslušné položky sú umiestnené v zónach, čisté a špinavé sú oddelené, vymenené včas a dekontaminované na mieste.Bežná dezinfekcia: Dezinfekčný prostriedok s obsahom chlóru je hlavným riešením pre väčšie plochy a pre malé plochy možno použiť 75% alkohol.Dobrým spôsobom, ako sa vysporiadať s aerosólmi, je otváranie okien na vetranie a dezinfekciu vzduchu možno vykonávať aj pomocou ultrafialových lúčov, filtrácie a dezinfekcie vzduchu.

Kľúčové väzby a parametre stanovenia nukleovej kyseliny SARS-CoV-2 (fluorescenčná RT-PCR v reálnom čase)

Hoci laboratóriá vo všeobecnosti venujú veľkú pozornosť „detekcii nukleových kyselín“, v skutočnosti je „extrakcia“ nukleovej kyseliny tiež jedným z kľúčových krokov úspešnej detekcie, ktorá úzko súvisí so zberom a skladovaním vzoriek vírusov.

V súčasnosti najpoužívanejšie respiračné vzorky, ako sú výtery z nosohltanu, využívajú druhú metódu, ktorou je inaktivačný (konzervačný) roztok pripravený na báze extrakcie nukleovej kyseliny a lyzačného roztoku.Na jednej strane môže tento roztok na ochranu vírusu denaturovať proteín vírusu, stratiť svoju aktivitu a už nie je infekčný a zlepšiť bezpečnosť v štádiu transportu a detekcie;na druhej strane môže priamo rozbiť vírus, aby sa uvoľnila nukleová kyselina, eliminoval sa enzým rozkladajúci nukleovú kyselinu a vírus sa zabránil.RNA je degradovaná.

Roztok na odber vzoriek vírusu pripravený na základe extrakčného lyzačného roztoku nukleovej kyseliny.Hlavnými zložkami sú vyvážené soli, chelatačné činidlo kyselina etyléndiamíntetraoctová, soľ guanidínu (guanidín izotiokyanát, guanidín hydrochlorid atď.), aniónová povrchovo aktívna látka (dodekán) síran sodný), katiónová povrchovo aktívna látka (tetradecyltrimetylamónium šťavelan), fenol, 8-hydroxy- alebo viac hydroxytrechinolín, proteíny a ďalšie zložkyV súčasnosti existuje mnoho typov súprav na extrakciu nukleových kyselín a používajú sa rôzne činidlá na extrakciu a čistenie nukleových kyselín.Aj keď sa použije rovnaké extrakčné a purifikačné činidlo nukleovej kyseliny, extrakčné postupy každej súpravy sú odlišné.

V súčasnosti sú produkty súpravy na detekciu nukleových kyselín schválené Národnou správou medicínskych produktov vybrané na základe génov ORF1ab, E a N v genóme SARS-CoV-2.Princípy detekcie rôznych produktov sú v podstate rovnaké, ale ich priméry a konštrukcie sond sú odlišné.Existujú segmenty s jedným cieľom (ORF1ab), segmenty s dvoma cieľmi (ORF1ab, N alebo E) a segmenty s tromi cieľmi (ORF1ab, N a E).Rozdiel medzi detekciou a interpretáciou, extrakciou nukleových kyselín a fluorescenčným RT-PCR reakčným systémom v reálnom čase by mal byť uvedený v príslušných pokynoch súpravy a odporúča sa, aby používatelia prísne dodržiavali interpretačnú metódu uvedenú v pokynoch na interpretáciu súpravy.Spoločné oblasti, priméry a sekvencie sond amplifikované fluorescenčnou RT-PCR v reálnom čase sú znázornené na P3.

P3 Umiestnenie cieľa amplikónu SARS-CoV-2 na genóme a sekvencia primérov a sond

Interpretácia výsledkov stanovenia nukleovej kyseliny SARS-CoV-2 (Real-Tfluorescenčná RT-PCR)

„Plán prevencie a kontroly pneumónie pre infekciu SARS-CoV-2 (druhé vydanie)“ po prvý raz objasnil kritériá na posudzovanie výsledkov amplifikácie jedného génu:

1. Žiadny Ct alebo Ct≥40 je negatívny;

2. Ct<37 je pozitívny;

3. Hodnota Ct 37-40 je oblasť šedej stupnice.Odporúča sa experiment zopakovať.Ak má výsledok prepočtu Ct<40 a amplifikačnej krivky zjavné vrcholy, vzorka je hodnotená ako pozitívna, v opačnom prípade je negatívna.

Tretie vydanie príručky a štvrté vydanie príručky pokračovali vo vyššie uvedených kritériách.Z dôvodu rôznych cieľov používaných v komerčných zostavách však vyššie uvedené 3. vydanie príručky neuvádza kritériá na určenie kombinácie cieľov, pričom sa zdôrazňuje, že prednosť majú pokyny poskytnuté výrobcom.Počnúc piatym vydaním usmernení boli objasnené dva ciele, najmä kritériá posudzovania pre jeden cieľ, ktorý je ťažké posúdiť.To znamená, že ak chce laboratórium potvrdiť, že prípad je pozitívny na detekciu nukleovej kyseliny SARS-CoV-2, musí byť splnená 1 z 2 podmienok:

(1) Dva ciele SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) v tej istej vzorke sú pozitívne testované fluorescenčnou RT-PCR v reálnom čase.Ak je jeden cieľ pozitívny, vyžaduje sa opätovné odoberanie vzoriek a opätovné testovanie.Ak sú výsledky testu Ak je jediný cieľ stále pozitívny, hodnotí sa ako pozitívny.

(2) Dve vzorky fluorescenčnej RT-PCR v reálnom čase vykázali jeden cieľ pozitívny v rovnakom čase alebo dve vzorky rovnakého typu ukázali jeden pozitívny výsledok testu, ktorý možno považovať za pozitívny.Usmernenia však tiež zdôrazňujú, že negatívne výsledky testovania nukleových kyselín nemôžu vylúčiť infekciu SARS-CoV-2.Je potrebné vylúčiť faktory, ktoré môžu spôsobiť falošne negatívne výsledky, vrátane nízkej kvality vzorky (respiračné vzorky z orofaryngu a iných častí), príliš skorý alebo príliš neskorý odber vzoriek, vzorky neboli správne uložené, transportované a spracované a samotná technológia mala problémy (variácie vírusov, inhibícia PCR) atď.

Príčiny falošných negatív pri detekcii SARS-CoV-2

Pojem „falošne negatívny“ pri testovaní nukleových kyselín, o ktorý sa v súčasnosti hovorí, sa často vzťahuje na „falošne negatívne výsledky“, pri ktorých sú výsledky testov nukleových kyselín v rozpore s klinickými prejavmi, to znamená, že klinické symptómy a výsledky zobrazovania sú vysoko podozrivé z COVID-19, ale testy na nukleové kyseliny sú mnohokrát vždy „negatívne“.Centrum klinického laboratória Národnej zdravotníckej komisie vysvetlilo „falošne negatívny“ test na SARS-CoV-2.

(1) V bunkách infikovanej osoby je určité množstvo vírusu.Existujúce údaje ukazujú, že po infekcii tela vírusom sa vírus dostane do hrdla cez nos a ústa, potom do priedušnice a priedušiek a potom sa dostane do alveol.Infikovaná osoba zažije inkubačné obdobie, mierne symptómy a potom proces závažných symptómov a rôznych štádií ochorenia.A množstvo vírusu prítomného v rôznych častiach tela je rôzne.

Z hľadiska vírusovej záťaže bunkových typov, alveolárne epitelové bunky (dolné dýchacie cesty)> epitelové bunky dýchacích ciest (horné dýchacie cesty)> fibroblasty, endotelové bunky a makrofágy atď.;z typu vzorky tekutina z alveolárneho výplachu (najúžasnejšia)>spúta s hlbokým kašľom>výter z nosohltanu>výter z orofaryngu>krv.Okrem toho je možné vírus zistiť aj vo výkaloch.Avšak vzhľadom na pohodlie operácie a akceptáciu pacientov je bežne používaným poradím klinických vzoriek orofaryngeálny výter>nazofaryngeálny výter>bronchiálna laváž (komplexná operácia) a hlboký spútum (zvyčajne suchý kašeľ, ťažko dostupný).

Preto je množstvo vírusu v bunkách orofaryngu alebo nazofaryngu niektorých pacientov malé alebo extrémne nízke.Ak sa na testovanie odoberú iba vzorky z orofaryngu alebo nosohltanu, vírusová nukleová kyselina sa nezistí.

(2) Počas odberu vzorky sa nezobrali žiadne bunky obsahujúce vírus alebo sa vírusová nukleová kyselina účinne nezachovala.

[① Nesprávne miesto odberu, napríklad pri odbere orofaryngeálnych výterov nie je dostatočná hĺbka odberu, zozbierané výtery z nosohltanu sa neodoberajú hlboko v nosovej dutine atď. Väčšina odobratých buniek môžu byť bunky bez vírusov;

②Odberové tampóny sa používajú nesprávne.Ako materiál hlavice tampónu sa odporúčajú napríklad syntetické vlákna ako PE vlákno, polyesterové vlákno a polypropylénové vlákno.V skutočnej prevádzke sa používajú prírodné vlákna, ako je bavlna (silná adsorpcia bielkovín a nie je ľahké ich vymývať) A nylonové vlákna (slabá absorpcia vody, čo vedie k nedostatočnému objemu vzorky);

③Nesprávne používanie skúmaviek na uchovávanie vírusov, ako je nesprávne použitie polypropylénových alebo polyetylénových plastových skúmaviek, ktoré ľahko absorbujú nukleové kyseliny (DNA/RNA), čo vedie k zníženiu koncentrácie nukleovej kyseliny v skladovacom roztoku.V praxi sa odporúča používať polyetylén-propylénový polymérový plast a niektoré špeciálne upravené polypropylénové plastové nádoby na uchovávanie vírusových nukleových kyselín.]

[① Nesprávne miesto odberu, napríklad pri odbere orofaryngeálnych výterov nie je dostatočná hĺbka odberu, zozbierané výtery z nosohltanu sa neodoberajú hlboko v nosovej dutine atď. Väčšina odobratých buniek môžu byť bunky bez vírusov;

②Odberové tampóny sa používajú nesprávne.Ako materiál hlavice tampónu sa odporúčajú napríklad syntetické vlákna ako PE vlákno, polyesterové vlákno a polypropylénové vlákno.V skutočnej prevádzke sa používajú prírodné vlákna, ako je bavlna (silná adsorpcia bielkovín a nie je ľahké ich vymývať) A nylonové vlákna (slabá absorpcia vody, čo vedie k nedostatočnému objemu vzorky);

③Nesprávne používanie skúmaviek na uchovávanie vírusov, ako je nesprávne použitie polypropylénových alebo polyetylénových plastových skúmaviek, ktoré ľahko absorbujú nukleové kyseliny (DNA/RNA), čo vedie k zníženiu koncentrácie nukleovej kyseliny v skladovacom roztoku.V praxi sa odporúča používať polyetylén-propylénový polymérový plast a niektoré špeciálne upravené polypropylénové plastové nádoby na uchovávanie vírusových nukleových kyselín.]

(4) Prevádzka klinického laboratória nie je štandardizovaná.Podmienky prepravy a skladovania vzoriek, štandardizovaná prevádzka klinických laboratórií, interpretácia výsledkov a kontrola kvality sú kľúčovými faktormi na zabezpečenie presnosti a spoľahlivosti výsledkov testov.Podľa výsledkov externého hodnotenia kvality, ktoré vykonalo Centrum klinického laboratória Národnej zdravotníckej komisie v dňoch 16. – 24. marca 2020, z 844 laboratórií, ktoré dostali platné výsledky, bolo kvalifikovaných 701 (83,1 %) a 143 (16,9 %) nie.Kvalifikované, celkové laboratórne testovacie podmienky sú dobré, ale rôzne laboratóriá majú stále rozdiely v schopnosti obsluhy personálu, schopnosti jednocieľovej pozitívnej interpretácie vzoriek a kontrole kvality.

Ako znížiť falošnú negativitu detekcie nukleovej kyseliny SARS-CoV-2?

Zníženie falošných negatívov pri detekcii nukleových kyselín by sa malo optimalizovať zo štyroch aspektov vytvárania falošných negatívov.

(1) V bunkách infikovanej osoby je určité množstvo vírusu.Koncentrácia vírusu v rôznych častiach tela podozrivých nakazených osôb bude v rôznych časoch odlišná.Ak nie je hltan, môže to byť v bronchiálnej výplachovej tekutine alebo výkaloch.Ak je možné na testovanie odobrať viacero typov vzoriek v rovnakom čase alebo v rôznych štádiách progresie ochorenia, pomôže to vyhnúť sa falošným negatívam.

(2) Bunky obsahujúce vírus by sa mali odoberať počas odberu vzoriek.Tento problém možno do značnej miery vyriešiť posilnením odbornej prípravy zberateľov vzoriek.

(3) Spoľahlivé IVD reagencie.Uskutočnením výskumu hodnotenia detekčnej účinnosti činidiel na národnej úrovni a diskusiou o existujúcich problémoch možno ďalej zlepšiť účinnosť detekcie činidiel a zlepšiť citlivosť analýzy.

(4) Štandardizovaná prevádzka klinických laboratórií.Posilnením odbornej prípravy laboratórneho personálu, neustálym zlepšovaním systému manažérstva kvality laboratória, zabezpečením primeraných delení a zlepšovaním schopnosti personálu odhaľovať je možné znížiť falošné negatívy spôsobené nesprávnou laboratórnou prevádzkou.

Dôvody opätovného pozitívneho testu nukleových kyselín SARS-CoV-2 u zotavených a prepustených pacientov

„Plán diagnostiky a liečby COVID-19 (Skúšobné siedme vydanie)“ jasne stanovuje, že jedným z kritérií pre pacientov s COVID-19, ktorí majú byť vyliečení a prepustení z nemocnice, je, že dve po sebe idúce vzorky z dýchacích ciest majú negatívny test na nukleovú kyselinu (s odstupom najmenej 24 hodín), ale existuje len veľmi málo SARS-CoV-2 z rôznych dôvodov, že test nukleovej kyseliny bol opäť pozitívny u prepustených pacientov.

(1) SARS-CoV-2 je nový vírus.Je potrebné ďalej porozumieť jeho patogénnemu mechanizmu, úplnému obrazu spôsobeného ochorenia a charakteristike priebehu ochorenia.Preto je na jednej strane potrebné posilniť manažment prepustených pacientov a vykonávať 14-dňové lekárske pozorovanie.Vykonávať následné sledovanie, sledovanie zdravotného stavu a zdravotné poradenstvo, aby sa prehĺbilo pochopenie celého procesu vzniku, vývoja a výsledku ochorenia.

(2) Pacient môže byť znova infikovaný vírusom.Akademik Zhong Nanshan povedal: Keďže vyliečení pacienti majú protilátky, SARS-CoV-2 môže byť eliminovaný protilátkami, keď znovu napadnú.Existuje mnoho dôvodov, ktoré môžu byť príčinou uzdraveného pacienta, alebo to môže súvisieť s mutáciou vírusu, či dokonca príčinou laboratórneho vyšetrenia.Ak ide o samotný vírus, mutácia SARS-CoV-2 môže spôsobiť, že protilátka produkovaná zotaveným pacientom bude neúčinná proti mutovanému vírusu.Ak je pacient opäť infikovaný zmutovaným vírusom, test nukleových kyselín môže byť opäť pozitívny.

(3)Pokiaľ ide o laboratórne testovacie metódy, každá testovacia metóda má svoje obmedzenia.Detekcia nukleovej kyseliny SARS-CoV-2 je spôsobená výberom génovej sekvencie, zložením činidiel, citlivosťou metódy a ďalšími dôvodmi, čo vedie k tomu, že existujúce súpravy majú svoje vlastné nižšie detekčné limity.Po liečbe pacienta vírus v tele klesá.Keď je vírusová záťaž v testovanej vzorke pod spodnou hranicou detekcie, objaví sa „negatívny“ výsledok.Tento výsledok však neznamená, že vírus v tele úplne zmizol.Vírus môže byť po ukončení liečby.Resurgence“, pokračujte v kopírovaní.Preto sa odporúča kontrola raz týždenne do 2 až 4 týždňov po prepustení.

(4) Nukleová kyselina je genetický materiál vírusu.Vírus je usmrtený po tom, čo pacient podstúpil antivírusovú liečbu, ale zostávajúce fragmenty vírusovej RNA sú stále zadržiavané v ľudskom tele a nie sú úplne odstránené z tela.Niekedy môže byť za určitých okolností viac zachovaná.Dlho a v tomto čase bude test nukleových kyselín „prechodne“ pozitívny.S predlžovaním doby zotavenia pacienta, po postupnom vyčerpaní zvyškov RNA fragmentov v tele, môže byť výsledok testu nukleových kyselín negatívny.

(5) Výsledok testu nukleových kyselín SARS-CoV-2 dokazuje iba prítomnosť alebo neprítomnosť vírusovej RNA a nemôže dokázať aktivitu vírusu a či je vírus prenosný.Je potrebné dokázať, či sa pacient, ktorý má opäť pozitívny test na nukleovú kyselinu, opäť stane zdrojom infekcie.Je potrebné vykonať kultiváciu vírusu na klinických vzorkách a kultivovať „živý“ vírus, aby sa dokázalo, že je infekčný.

Zhrnutie

Stručne povedané, nie je možné úplne vyhnúť sa falošným negatívnym výsledkom testov nukleových kyselín SARS-CoV-2, pozitívnym opakovaným testom a iným stavom, ktoré nie sú v súlade s klinickými prejavmi.Pri samotnom skríningu a testovaní sa odporúča kombinovať klinické symptómy, zobrazovacie vyšetrenia (CT) a experimenty Výsledky laboratórnych testov (test nukleových kyselín + test na vírus špecifické protilátky) pre komplexnú diagnostiku, aby sa predišlo zmeškanej diagnóze a chybnej diagnóze.Ak sa zistí, že výsledky testu sú zjavne v rozpore s klinickými prejavmi, odporúča sa vykonať komplexnú analýzu celého prepojenia testu (odber vzoriek, obeh a spracovanie), aby sa vylúčila skorá infekcia vírusom SARS-CoV-2, recidivujúca infekcia alebo kombinácia s inými respiračnými vírusovými infekciami atď.Ak to podmienky dovoľujú, odporúča sa odobrať citlivejšie vzorky, ako je spútum alebo tekutina z alveolárneho výplachu na opätovné vyšetrenie.

Súvisiace produkty:

Súprava na detekciu nukleových kyselín SARS-CoV-2 (metóda fluorescenčnej sondy multiplexnej PCR)